背景与目的：非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是世界范围内癌症死亡的首要原因。超过15%的非小细胞肺癌病人诊断之初已经并发了恶性胸腔积液(malignant pleural effusion, MPE),并且随着病情的进展,50%以上的病人将并发恶性胸腔积液。恶性胸腔积液是肺癌病人较差预后的标志之一,直至目前我们对恶性胸腔积液病因及其具体机制的了解还存在很多的不足。一般认为肿瘤所致恶性胸腔积液是由以下几条途径产生的：①淋巴系统引流障碍,此类积液常为浆液性或乳糜性,而非血性。②胸膜的转移性病变或原发肿瘤及伴有炎症致毛细血管通透性增高引起,此类积液多为血性。③肿瘤患者因营养不良所致低蛋白血症引起的漏出性胸腔积液。④癌栓脱落引起肺栓塞可引起胸腔积液。⑤胸内肿瘤接受治疗时对胸膜造成的刺激或损伤。⑥部分学者研究发现血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在恶性胸腔积液产生中起到很重要的作用。尽管恶性肿瘤的治疗手段在进步,但是总体来说目前为止恶性胸腔积液治疗方法比较有限,治疗效果不尽如人意。临床上恶性肿瘤患者一旦并发了恶性胸腔积液,即说明其病变已到晚期。恶性胸腔积液增长迅速,常伴有胸闷、气急、心悸等症状,如不及时治疗可造成患者呼吸循环功能障碍、低蛋白血症、贫血,甚至危及生命。不断增多的积液量使肺扩张受到了限制,因而能严重影响心肺功能,并且易并发肺不张和反复感染。确诊恶性胸腔积液后,一般患者的生存时间小于六个月。因此,恶性胸腔积液治疗的主要目的在于有效地控制积液量的增长,缓解病人的呼吸困难症状,提高病人生活质量,进一步延长生存期。因而,迅速有效的抑制恶性胸腔积液的增长是整个肿瘤治疗中环节中的重中之重。1627年,Asellius首次发现了淋巴系统。经过几个世纪的研究,目前人们对淋巴管的结构和功能的认识已逐步深入。与毛细血管相比,毛细淋巴管的管腔相对较大且不规则,管壁较薄,仅由内皮细胞构成,基底膜不连续,内皮间隙开放,管周通过网状纤维和胶原组织与细胞外基质相连；内皮细胞过度拉伸可使管壁变得更薄,从而形成淋巴管特有的高通透性。恶性肿瘤的淋巴管新生和淋巴结转移与血管内皮生长因子C (Vascular endothelial growth factor C, VEGF-C)的高表达有关。VEGF-C的特异性酪氨酸激酶受体VEGFR-3(Vascular endothelial growth factor receptor-3, VEGFR-3)主要表达于淋巴管的上皮细胞内,且VEGF-C主要通过与VEGFR-3的结合,来诱导瘤内和瘤旁淋巴管形成及淋巴结转移,这也是大部分肿瘤转移的主要途径。在胸膜转移瘤中,肿瘤细胞分泌较多的VEGF-C,致使肿瘤淋巴管生成及区域淋巴结转移增多,且新生的淋巴管管腔较脆,较之正常淋巴管更易于破裂,导致淋巴液渗漏形成恶性胸腔积液。癌细胞发生淋巴结转移,经淋巴结进入淋巴循环,聚集成团堵塞淋巴管,导致淋巴引流障碍。另一方面,肿瘤新生淋巴管管腔迂曲,内皮细胞间隙增大,易于肿瘤细胞沿淋巴管的转移及管腔内淋巴液的渗漏。上述也是恶性胸腔积液形成的两个重要原因。多项实验已证实伊曲康唑(Itraconazole)具有抑制血管内皮细胞生长的能力,在基质胶转移瘤模型中伊曲康唑具有抑制血管生成和肿瘤生长的作用。众所周知,肿瘤血管新生与淋巴管新生具有相似的途径,且二者共同参与了恶性胸腔积液的形成。但伊曲康唑是否同时具有抑制淋巴管生成和淋巴结转移的作用,进而达到治疗恶性胸腔积液的目的,目前国内外关于此项研究的报道极少。本研究拟用经胸腔注射肿瘤细胞的方式来建立荷瘤恶性胸腔积液裸鼠模型。成功建模后应用不同剂量的伊曲康唑经胸膜腔内局部注射方式来处理恶性胸腔积液小鼠,并设立空白对照组来观察伊曲康唑对恶性胸腔积液的作用以及其对肿瘤淋巴结转移和淋巴管生成方面的作用,以期为今后恶性胸腔积液的抗淋巴管生成及淋巴结转移治疗提供一定的理论依据。实验方法：第一部分裸鼠恶性胸腔积液模型的建立本研究利用GFP-LLC (green fluorescent protein-Lewis lung cancer)肺癌细胞,取其生长状态良好者悬浮至磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffer solution, PBS)中,调整浓度至1×10∧6/50μl,经胸腔注射的方式构建肺癌细胞恶性胸腔积液裸鼠模型,共30只裸鼠。接种细胞后每天观察小鼠的生命体征、肿瘤生长。接种肿瘤细胞后第4天开始,每3天处死2只小鼠,解剖后先后在近红外荧光显微镜和肉眼状态下观察小胸腔肿瘤形成情况,并计量小鼠胸腔积液体积。从接种肿瘤细胞后第7天开始,每7天给予小鼠一次胸部CT扫描,观察小鼠胸腔积液形成情况。第二部分伊曲康唑对恶性胸腔积液裸鼠淋巴管生成的影响选取30只4-6周龄的裸鼠,动物随机分为3组,每组10只,按前述造模方法建立荷瘤裸鼠胸腔积液模型。建模后第4天开始,治疗组分别经胸膜腔注射25mg/kg的高剂量伊曲康唑(high dose of itraconazole, H-ITCZ),8mg/kg低剂量伊曲康唑(low dose of itraconazole, L-ITCZ),对照组则胸腔注射50u1羟丙基β-环糊精(Hydroxypropyl β-cyclodextrin, H-β-C,130mg/ml)溶液。所有实验裸鼠每3日经胸腔注射一次药物,共持续4次。在GFP-LLC细胞接种后第14天,所有小鼠经腹腔注射麻醉后行胸部CT检查,以观察胸腔积液形成情况。在GFP-LLC细胞接种后第16天,全部小鼠麻醉处死解剖后,用lml注射器经小鼠纵膈以开窗方式抽取胸腔积液,分别计量各组胸水平均体积。胸腔积液离心后上清-80℃保存,备用。上清行ELISA法检测胸腔积液中VEGF-C浓度。胸腔积液离心沉渣行改良Gimsa法染色,观察细胞形态及细胞类型。小鼠解剖抽吸胸水先后在近红外荧光显微镜(Near-infrared fluorescence microscopy, NIR fluorescence microscopy)和自然光下拍照,分别观察小鼠胸腔、胸壁及纵膈等表面的肿瘤结节,同时观察肿瘤结节的绿色荧光表达情况,计数肿瘤结节数量。取肿瘤组织标本部分行HE (hematoxylin and eosin)染色,剩余标本福尔马林液中保存24小时,蜡封及切片后行免疫组化(Immunohistochemistry, IHC)染色,观察肿瘤组织淋巴管中微淋巴管密度(microlymphat ic vessel density,MLVD)和VEGF-C的表达情况。结果：第一部分经胸腔种植肿瘤细胞的方式可建立恶性胸腔积液裸鼠模型小鼠接种肿瘤细胞后第4天开始,近红外荧光成像系统下可发现小鼠胸腔内散在少量荧光。随着小鼠接种肿瘤的时间逐渐延长,小鼠胸腔肿瘤体积逐渐增加,肿瘤结节数逐渐增多。小鼠胸部CT检查结果提示：第7天、第14天和第21天小鼠的成胸水率分别为28%、74%和81%。小鼠平均生存时间为16.7天.解剖后见小鼠所有胸腔积液均为血性,静止后不凝固,胸腔积液平均体积在第10天以后逐渐增加并在第16天达到峰值,约为0.5ml。第二部分伊曲康唑可抑制恶性胸腔积液裸鼠淋巴管生成小鼠胸部CT检查结果提示高浓度伊曲康唑组胸腔积液不明显,仅有少量。低浓度伊曲康唑组和羟丙基β-环糊精组可见明显胸腔积液,其中羟丙基β-环糊精组胸腔积液最为明显,小鼠右侧胸腔可见大量积液。在GFP-LLC细胞接种后第16天处死全部小鼠后经纵膈开窗抽取胸腔积液,所有积液均为血性,静止后不凝固。高浓度伊曲康唑组、低浓度伊曲康唑组和羟丙基β-环糊精组小鼠平均胸水体积分别为311.19±27.20ul、445.64±27.75ul、575.76±32.61ul。实验结果表明高浓度伊曲康唑处理组小鼠胸水量最少,提示随着伊曲康唑药物浓度的增高,伊曲康唑对恶性胸腔积液生成的抑制作用愈加明显。高浓度伊曲康唑组与低浓度伊曲康唑组及对照组胸水差异分别具有统计学意义(P<0.01)。小鼠解剖后充分暴露胸腔和腹腔,自然光下可见小鼠胸腔肿瘤广泛转移,遍及脏、壁层胸膜,纵膈亦可见大量淋巴结及肿瘤转移病灶,与近红外荧光显微镜下所见小鼠胸腔转移瘤情况类似。本实验中发现,近红外荧光照片对小鼠胸腔微小转移灶显像更加清晰,易于辨认。计数小鼠胸腔肿瘤结节结果示,羟丙基p-环糊精组、低浓度伊曲康唑组和高浓度伊曲康唑组肿瘤结节数量分别为27.40+3.92、21.40±3.37和11.55±3.28。高浓度伊曲康唑组和低浓度伊曲康唑组及羟丙基p-环糊精组肿瘤结节差异分别具有统计学意义(P<0.05),且低浓度伊曲康唑组与羟丙基-p环糊精组之间也具有统计学差异(P<0.05)。实验结果说明随着伊曲康唑药物浓度的提高,小鼠胸腔肿瘤转移灶和转移淋巴结数量均减少,这进一步证实了伊曲康唑能抑制肿瘤淋巴管生成和淋巴结转移。胸腔积液上清行ELISA法检测VEGF-C结果提示,随着伊曲康唑药物浓度的提高,胸腔积液中VEGF-C的表达逐渐减少。肿瘤组织病理染色结果提示小鼠胸腔肿瘤细胞核大,染色深,排练紊乱,为腺癌细胞系。肿瘤组织行免疫组化染色鉴定肿瘤微淋巴管密度(MLVD)结果示：羟丙基p-环糊精组、低浓度伊曲康唑组和高浓度伊曲康唑组微淋巴管密度分别为24.1±2.51,20.5±1.58和14.1±1.45,各组间分别具有统计学差异(P<0.05)。VEGF-C阳性率：羟丙基p-环糊精组、低浓度伊曲康唑组和高浓度伊曲康唑组的阳性率分别为65%,47%,36%,.治疗组与对照组之间都具有统计学差异(P<0.05)。结论：1.本实验成功建立了经胸腔注射肿瘤细胞建立的裸鼠恶性胸腔积液模型,为研究恶性胸腔积液的治疗提供了直观、简便的平台。2.本实验证实了高剂量伊曲康唑能抑制荷瘤恶性胸腔积液裸鼠淋巴管生成,进而抑制淋巴结转移,最终抑制了荷瘤裸鼠恶性胸腔积液的生成。