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背景与目的瘢痕疙瘩是临床上常见的病理性瘢痕,以成纤维细胞的异常增殖和细胞外基质成分的过度堆积为主要特征。其生长行为有类似肿瘤的特性,表现为向周围正常皮肤侵袭性生长、单纯手术切除术后易复发等,发病机制至今不明,在治疗上尚无特效方法,是目前整形外科研究的热点和难点问题之一。在哺乳动物中,鞘氨醇激酶(sphingosine kinase,SphK)有多种亚型,其中已有2种亚型被克隆出来,即SphK1和SphK2。SphK1具有促进细胞生长、抑制细胞凋亡的作用,SphK2主要作用是促进细胞凋亡。转化生长因子β(ransforminggrowth factorβ,TGF-β)是导致病理性瘢痕产生的重要因素之一,而且在人皮肤和肺的成纤维细胞中TGF-β1上调SphK1的表达。目前,国内外有关瘢痕疙瘩成纤维细胞SphK1和SphK2的表达及其与TGF-β1的关系未见报道。本研究通过检测SphK1和SphK2在人正常皮肤成纤维细胞和瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达差异,推断两者在瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖过程中的作用;通过检测加入TGF-β1前后SphK1和SphK2在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达差异,探讨SphK1和SphK2与TGF-β的关系,以期能进一步阐明瘢痕疙瘩的发病机制。方法1、收集12例瘢痕疙瘩患者手术切除的瘢痕疙瘩及其周围正常皮肤标本,组织块法培养成纤维细胞,取第3-8代成纤维细胞进行实验,分为正常皮肤组、瘢痕疙瘩组和瘢痕疙瘩加转化生长因子β1(TGF-β1)组(瘢痕疙瘩+TGF-β1组)。2、各组成纤维细胞分别培养爬片后,用免疫荧光法观察各组细胞中SphK1和SphK2蛋白的分布;3、Trizol法提取各组细胞的总RNA,反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA,Real-Time PCR法定量检测SphK1和SphK2 mRNA的表达;4、用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白,BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度,蛋白质印迹法检测SphK1和SphK2蛋白的表达。结果1、在各组成纤维细胞中,SphK1蛋白均主要分布于细胞核,而SphK2蛋白在细胞核和胞质中均有表达。2、正常皮肤组、瘢痕疙瘩组和瘢痕疙瘩+TGF-β1组SphK1mRNA表达分别是0.0383±0.0147、0.0608±0.0190和0.0790±0.0280,可见瘢痕疙瘩组SphK1mRNA表达明显高于正常皮肤组,其差异有统计学意义(P＜0.05);瘢痕疙瘩+TGF-β1组SphK1mRNA表达明显高于瘢痕疙瘩组,其差异有统计学意义(P＜0.05)。正常皮肤组、瘢痕疙瘩组和瘢痕疙瘩+TGF-β1组SphK2 mRNA表达分别是0.0036±0.0011、0.0032±0.0014和0.0033±0.0021,3组之间的表达差异无统计学意义(P＞0.05)。各组SphK1mRNA的表达较SphK2mRNA表达高,其差异有统计学意义(P＜0.05);正常皮肤组、瘢痕疙瘩组和瘢痕疙瘩+TGF-β1组SphK1/SphK2mRNA比值分别是10.5784±1.9007,20.2037±3.2254,22.7297±3.3306,可见瘢痕疙瘩组SphK1/SphK2比值明显高于正常皮肤组,其差异有统计学意义(P＜0.01);瘢痕疙瘩+TGF-β1组SphK1/SphK2mRNA比值明显高于瘢痕疙瘩组,其差异有统计学意义(P＜0.05)。3、正常皮肤组、瘢痕疙瘩组和瘢痕疙瘩+TGF-β1组SphK1蛋白表达分别是0.6800±0.11260、0.8308±0.10930和1.4267±0.19380,可见瘢痕疙瘩组SphK1蛋白表达明显高于正常皮肤组,其差异有统计学意义(P＜0.05);瘢痕疙瘩+TGF-β1组SphK1蛋白表达明显高于瘢痕疙瘩组,其差异有统计学意义(P＜0.01)。正常皮肤组、瘢痕疙瘩组和瘢痕疙瘩+TGF-β1组SphK2 mRNA表达分别是0.0763±0.0091、0.0724±0.0069和0.0773±0.0083,3组之间的表达差异无统计学意义(P＞0.05)。各组SphK1蛋白表达较SphK2蛋白表达高,差异有统计学意义(P＜0.05);正常皮肤组、瘢痕疙瘩组和瘢痕疙瘩+TGF-β1组SphK1/SphK2蛋白比值分别是8.8747±0.6927,11.4413±0.5012,18.4230±0.7713,可见瘢痕疙瘩组SphK1/SphK2蛋白比值明显高于正常皮肤组,其差异有统计学意义(P＜0.01);瘢痕疙瘩+TGF-β1组SphK1/SphK2比值明显高于瘢痕疙瘩组,其差异有统计学意义(P＜0.01)。结论1、在正常皮肤和瘢痕疙瘩成纤维细胞中,SphK1和SphK2均有表达,但二者的分布有差异,SphK1主要在细胞核中表达,而SohK2在细胞核和细胞浆中均有表达。2、SphK1在正常皮肤和瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达有差异,在瘢痕疙瘩成纤维细胞中SphK1mRNA水平和蛋白水平较正常皮肤成纤维细胞高,说明SphK1的高表达与瘢痕疙瘩的发生发展有密切的关系,SphK1可能是促进瘢痕疙瘩成纤维细胞过度生长的一个重要因子;SphK2在瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞中的mRNA和蛋白表达差异无统计学意义,说明SphK2虽有促凋亡的作用,但不能有效的促进瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡,不能有效地对抗SphK1导致促瘢痕疙瘩成纤维细胞生长的作用。SphK1和SphK2作用的失衡,可能是导致瘢痕疙瘩增生的重要机制之一。3、SphK1mRNA和蛋白在正常皮肤和瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达均比SphK2高,瘢痕疙瘩成纤维细胞中SphK1/SphK2mRNA和蛋白比值较正常皮肤成纤维细胞为高,存在SphK1的高表达,反映了瘢痕疙瘩和正常皮肤中SphK1、SphK2的含量并不是相等的,在维持成纤维细胞的生长增殖过程中的作用是有差异的;SphK1/SphK2比值增高,可能与瘢痕疙瘩的过度生长有关,可以预测SphK1/SphK2比值是判断瘢痕疙瘩增生程度的指标。4、在瘢痕疙瘩成纤维细胞中加入TGF-β1刺激后,SphK1 mRNA水平和蛋白水平均表达增高,SphK2 mRNA水平和蛋白水平表达均无显著差异,说明TGF-β1可促进SphK1在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达,提示SphK1可能参与了TGF-β信号转导通路的作用。