水稻病毒病是水稻生产上一类重要的病害,广泛发生在我国水稻种植的地区。水稻病毒主要由稻飞虱等昆虫介体传播。伴随着稻飞虱的爆发,水稻病毒病流行危害,对粮食生产造成了极大威胁。本研究中探索了水稻病毒和其传播介体之间的联系；研究了水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)的沉默抑制子和运动蛋白两个关键蛋白的作用机制,旨在为更好地防治水稻病毒的危害提供帮助。1白背飞虱转录组及感染SRBSDV后基因表达差异比较运用新一代测序技术,构建了白背飞虱携带南方黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)以及不带毒的文库,比较了带毒以后介体白背飞虱的基因表达的差异。得到了白背飞虱81388个不同的Unigene;通过和已报道的灰飞虱和褐飞虱转录组信息比较,发现三者具有非常类似的基因功能分类。通过生物信息学预测发现在白背飞虱里存在7291个简单重复序列。通过比较带毒后和不带毒白背飞虱基因表达的差异,发现SRBSDV感染介体白背飞虱后会影响其初级代谢以及泛素化介导的蛋白酶降解途径,发现5.5%细胞骨架系.统相关的基因表达发生了变化,还发现白背飞虱的免疫系统及RNA干扰途径随着病毒的侵染会被激活。研究结果首次阐述了呼肠孤病毒科植物病毒与其介体之间的关系,为研究水稻重要病害的传播以及致病机制提供了依据。2RSV编码的NS3蛋白的灰飞虱互作蛋白RPN3的鉴定构建了灰飞虱的cDNA文库,采用酵母双杂交的手段筛选到了一个26S蛋白酶系统的亚基RPN3能够和NS3互作,并且通过体外Pull-down的试验进行了验证。NS3是病毒沉默抑制子,具有不依赖序列特异性的dsRNA结合活性,首先利用植物系统研究了RPN3对NS3沉默抑制功能的影响,发现两者的互作对NS3沉默抑制子功能没有影响。利用酵母系统发现灰飞虱的RPN3能够互补酵母RPN3突变的菌株的“活性”；当同NS3一起转化时,灰飞虱互补酵母突变型的能力大大下降,不仅影响了总蛋白的泛素化水平,而且对其泛素化蛋白降解途径的蛋白降解能力也有很大的破坏。推测NS3和RPN3互作直接影响了RPN3参与形成蛋白酶复合体的能力。克隆了RPN3的一个433位氨基酸由异亮氨酸(Ⅰ)突变为苏氨酸(T)的点突变体,该突变不能和NS3互作,但是不影响其互补酵母RPN3突变体的能力。当突变体RPN3和NS3共同转化到酵母突变体时,NS3对其互补突变体活性的影响不大,为NS3通过互作影响FLPN3功能提供了直接证据。发现当利用dsRNA介导的基因沉默技术使RPN3基因表达受到抑制时,带毒的灰飞虱体内病毒含量会逐渐上升,说明蛋白酶系统是抵抗RSV的一个重要方式。当沉默RPN3后,灰飞虱会因为体内病毒含量上升而增加传毒能力。突变体分析发现NS3能够和RPN3的C段互作,这种互作不仅需要26S蛋白酶调控亚基的C末端保守区域还需要PCI domain的末端一部分。我们发现的433位异亮氨酸(Ⅰ)突变为苏氨酸(T)的点突变体即位于RPN3的C末端。在江苏盐城分离的灰飞虱中发现存在RPN3433位异亮氨酸(Ⅰ)突变为苏氨酸(T)的点突变体,说明在自然进化中该类点突变是有意义的。泛素化蛋白酶系统是生物最重要的系统,RSV编码的NS3蛋白能够通过直接和RPN3互作而影响其功能,从而有利于病毒自身,但是对灰飞虱来说病毒的过度繁殖是不利的。因此在长期进化中,RSV高发地区选择压造成灰飞虱进化出一些逃避机制,本研究在灰飞虱中发现的RPN3点突变即是寄主在不影响蛋白酶功能的基础上逃避RSV不利影响的重要方式。3RSV在三种寄主中产生小RNA的多样性分析及介体灰飞虱中存在RNA干扰介导的抗病毒的证实小RNA介导的基因沉默在植物以及无脊椎动物抵抗病毒侵染中发挥了重要作用。之前已经有很多植物病毒侵染寄主植物后产生小RNA的报道,但是没有同一种植物病毒侵染植物寄主以及在传播介体昆虫中产生小RNA的多样性的报道。水稻条纹病毒(RSV)除了能够在水稻及传播介体灰飞虱中复制外,还能够系统侵染本氏烟。运用大规模深度测序的方法研究了RSV侵染传播介体灰飞虱,水稻以及本氏烟后在三种寄主中产生小RNA的群体差异情况。还首次克隆了灰飞虱中RNA干扰相关的原件如Dicers和Agronautes,并发现这些元件在三种稻飞虱中都很保守,揭示了该基因家族在昆虫进化中的功能保守性。运用双链RNA显微注射沉默基因的方法,发现当沉默Ago2基因表达后,RSV在灰飞虱中积累上升,为RNA干扰在介体灰飞虱抵抗RSV中发挥重要作用提供了直接证据。4RSV NSvc4在本氏烟胞间运动及在症状形成中的作用RSV编码的NSvc4是该病毒的运动蛋白。为了更好的了解该运动蛋白的定位性质以及运动机制,对该蛋白进行了深入地研究。发现NSvc4蛋白是利用寄主的微丝系统以及内质网系统到达胞间连丝(PD),当用Lat B和BFA分别破坏本氏烟的微丝和内质网系统后,瞬时表达NSvc4-GFP,到达胞间连丝的点刻状颗粒明显减少,而破坏微管后基本上对胞间连丝定位没有影响。当用化学药剂Lat B破坏本氏烟的微丝后,RSV侵染本氏烟的效率明显降低,证实了微丝系统而不是微管在RSV侵染寄主中发挥重要作用。通过软件预测发现NSvc4的106到125区域有一个跨膜的结构域,当突变该区域后NSvc4到达PD的数量明显减少,有很多点颗状的聚集体在胞内聚集,说明跨膜结构对NSvc4运动是必需的,也证实了NSvc4到达PD需要通过细胞内膜系统的运输。除了在胞间连丝发现有定位外,也发现NSvc4也能定位到叶绿体以及叶绿体外周；突变体分析发现NSvc4的N端1-73个氨基酸就足以使MP定位在叶绿体。当NSvc4在PVX表达载体上表达浸润本氏烟后,会比对照产生更严重的花叶以及坏死等现象；电镜观察发现其侵染的植物叶绿体膜有褶皱和突起,叶绿体膜受到了破坏。突变体分析发现NSvc4产生症状的区域和叶绿体定位没有直接关联。另外,将NSvc4在昆虫细胞(Spodoptera frugiperda9, sf-9)中表达发现其主要定位在细胞外周,不能产生管状结构,说明其运动方式和其进化上相近的另外一种负义植物病毒番茄斑萎病毒存在差异。5RSV沉默抑制子NS3蛋白抑制基因沉默机理研究RSV编码的NS3是沉默抑制子,但是还不清楚NS3蛋白是通过何种方式发挥沉默抑制作用的。已发现一些抑制子蛋白质中一些带正电荷的氨基酸能够以静电吸引结合具有磷酸基团负电荷的核酸分子(如siRNA),从而阻断基因沉默路径,为了验证NS3结合siRNA的能力与基因沉默抑制功能之间的联系以及明确NS3结合siRNA的区域,将NS3蛋白中保守位点的11个带正电荷氨基酸突变为甘氨酸等不带电荷的氨基酸,然后构建到植物表达载体中和野生型NS3分别浸润普通本氏烟和转基因本氏烟16c上验证抑制子活性。发现抑制子的活性与NS3蛋白结合siRNA能力大小密切相关,将173-175的KKR突变了为AAA后,NS3结合siRNA的能力下降1000倍,在植物体内NS3的沉默抑制功能几乎完全消失。证实了NS3蛋白是通过劫持siRNA干扰了基因沉默路径。