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目的：肾间质纤维化是多种肾脏疾病发展至终末期肾脏病的共同通路。肾间质肌成纤维细胞(myofibroblast，MyoF)是产生肾间质细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的重要细胞。转化生长因子β1(TGF-β1)是公认的致纤维化因子，它能诱导肾小管上皮细胞以肾小管上皮-肌成纤维细胞转分化(tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation，TEMT)机制活化，进而可以表达α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)，合成Ⅰ、Ⅳ型胶原(collagenⅠand IV)、纤维结合蛋白(fibronectin，FN)等细胞外基质成份，参与肾间质纤维化。Α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)是肌成纤维细胞的特异性标志物，是一种细胞骨架蛋白。在正常肾脏组织中除了血管平滑肌以外，很少表达a-SMA。但肾间质纤维化时，肾间质细胞胞浆、肾小管上皮细胞的基底侧，以及一些变性萎缩的小管上皮细胞胞浆都可以表达a-SMA。以Ⅰ型胶原为主的间质胶原，广泛存在于多种结缔组织中，在肾脏纤维化疾病的发生和发展中，起着不可或缺的作用。其过度表达是形成肾脏间质纤维化过程中的一个重要环节。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)是TGF-β促纤维化活性的下游信号介质，刺激细胞增殖及细胞外基质的形成，在肾脏纤维化发生、发展中有重要的作用。抑制CTGF基因表达显然有助于延缓肾脏纤维化进程，而应用常规抗纤维化药物抑制其表达的效果并不理想。RNAi技术能抑制靶基因的转录后表达，其作用类似于基因敲除。但基因表达并不是永远消除，因而又被称为“基因沉默”。本研究利用单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral occlusion，UUO)小鼠肾纤维化模型，采用尾静脉注射的方法整体转染CTGF-siRNA质粒抑制肾脏CTGF的表达，观察敲低CTGF表达对肾脏间质纤维化的影响。
方法：
小鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型的制备及活体CTGF基因转染
CD-1雄性12周小鼠随机分为3组：假手术组(sham)、UUO+pBAsi mU6 Neo质粒载体组(UUO+V)和UUO+pBAsi mU6 Neo CTGF siRNA 质粒组(UUO+CTGF siRNA)，每组8只小鼠。制备单侧输尿管梗阻(UUO)模型：水合氯醛(4 mg/kg)皮下注射使小鼠麻醉后局部剃毛，常规消毒铺孔巾，选择腹正中线切口，依次切开皮肤至腹腔，游离肾脏及输尿管，将左侧输尿管用组织钳托起中段部位，止血钳夹住，在两端用4.0丝线两次结扎左侧输尿管近肾盂段，剪断输尿管，然后连续缝合皮肤。假手术组手术入路方式同UUO组，进腹腔后分离左输尿管但不结扎输尿管。UUO+CTGF siRNA组小鼠于术前2天和术后3天给予尾静脉快速注射pBAsi mU6 Neo CTGF siRNA 质粒(1 mg/kg)；UUO+V组用同种剂量和方法注射pBAsi mU6 Neo质粒载体。UUO术后7天每组取6只小鼠，切取肾脏。取部分肾皮质组织置于4[％]多聚甲醛固定用于光镜观察及免疫组织化学染色；部分肾皮质组织用于提取蛋白及RNA。免疫组织化学染色法检测α-SMA的表达；Western blot检测CTGF及α-SMA的表达；半定量RT-PCR检测α-SMA mRNA的表达。
结果：
① Masson染色结果显示：Sham组小鼠1周后肾组织中肾小球大小、形态正常，肾间质、肾小管未见纤维增生改变。UUO+V组小鼠1周后肾间质、肾小管可见大量的胶原纤维增生。UUO+CTGF siRNA组结果：肾间质、肾小管可见胶原纤维，但比UUO+V组胶原纤维明显减少。
②免疫组织化学结果显示：在Sham组α-SMA仅表达于肾血管平滑肌肌层，偶在肾系膜区和肾小管间质细胞表达。与Sham组相比，UUO+V组7 d时α-SMA表达明显增加，广泛分布于肾间质细胞胞浆、肾小管上皮细胞的基底侧，以及一些变性萎缩的小管上皮细胞胞浆。UUO+CTGF siRNA组α-SMA的表达显著低于UUO+V组。
③Western-blot定量检测CTGF和α-SMA蛋白表达显示：与Sham组相比，UUO+V组CTGF和α-SMA蛋白表达显著高于Sham组；与UUO+V组相比，CTGF siRNA组CTGF和α-SMA蛋白表达则明显降低 (P<0.05)。
④ RT-PCR结果显示：与Sham组相比，UUO+V组α-SMA mRNA表达明显增加；与UUO+V组相比，UUO+CTGF siRNA组α-SMA mRNA的表达则明显降低 (P<0.05)。
结论：经小鼠尾静脉注射CTGF siRNA质粒能显著抑制小鼠肾CTGF和α-SMA基因表达并能有效抑制小鼠肾脏间质纤维化，提示CTGF siRNA有潜力成为防治肾脏间质纤维化的一种新策略。