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目的恶性血液病通常由多种复杂的染色体畸变或基因突变引起,单一突变的所致的生物学效应常常湮没与复杂的基因背景中。基因组编辑工具的丰富和快速发展使得在较短时间内,在多种生物学系统中,定点敲入或敲除预先设计好的DNA序列变得更为简单。在特定基因背景下通过转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)精确地修饰单个基因,建立背景完全可以对照的同源细胞系克隆,能够快速建立同源疾病模型,对于研究特定基因突变对于疾病的发生发展的作用和研发新的治疗手段具有重要意义。方法在本研究中,我们针对人FLT3.SF3B1基因和斑马鱼Sema4d基因,挑选合适靶点并设计多对TALENs序列,利用改进后的快速构建TALENs技术,合成并测序鉴定针对上述三个靶点的人工核酸酶。克隆原代标本的FLT3一ITD突变和定点突变SF3B1K700E点突变构建同源重组所需的供体DNA模板(包含或不包含cre-loxp抗性筛选标签)并构建SF3B1靶点的“信号灯”双荧光蛋白报告富集系统。然后利用核转染方式将TALENs或模板质粒导入K562靶细胞系中。通过细胞亚克隆化及PCR方法鉴定FLT3基因敲除克隆。通过抗生素筛选,CRE重组酶处理和PCR鉴定FLT3-ITD敲入克隆。利用流式分选通过双荧光蛋白报告系统富集SF3B1敲入克隆并克隆化鉴定。在斑马鱼系统中,将体外转录的TALENs mRNA显微注射单胞期受精卵,然后提取基因组DNA PCR T载鉴定。结果针对上述三个靶点设计的TALENs均显示出在活细胞中对基因组的切割效应,效率从3%-26%不等。同时成功获得K562细胞系上稳定遗传的FLT3单等位基因敲除的亚克隆多株,FLT3单等位基因ITD敲入亚克隆两株,SF3B1单等位基因K700E敲入亚克隆两株及对照野生型亚克隆数株。同时成功建立斑马鱼F0代Sema4d嵌合体模型。结论TALENs作为一种可定制的、构建简便、效率稳定且能在多种生物学系统中进行基因组编辑的工具,结合供体DNA模板和／或“信号灯”双荧光蛋白报告富集系统,能够在较短周期内建立同源细胞系疾病模型和斑马鱼嵌合体敲除模型,为后续基因突变的致病机制、生物学效应和治疗手段研究提供优良的平台。目的FLT3作为AML中发生突变频率最高的基因之一,其内部串联重复突变(ITD)或酪氨酸激酶域(TKD)突变引起的下游信号通路异常激活和野生型转录本的高表达对于AML临床预后具有重要意义。目前对FLT3的激酶活性抑制手段主要为小分子化合物抑制剂、中和性抗体和RNA干扰。为了特异并且持久的抑制FLT3的活性,我们尝试利用基因组编辑工具转录激活因子样效应物核酶(TALENs)靶向敲除白血病细胞中的FLT3基因并评估对肿瘤生物学效应的影响。方法构建针对FLT3基因编码近膜区的序列设计的TALENs,将编码TALENs的质粒核转染K562细胞后进行克隆筛选以获得FLT3基因敲除的K562克隆和对照克隆。利用PCR测序检测20个最可能的TALENs脱靶基因组位点。利用跨不同的外显子的引物通过RT-PCR检测FLT3转录本水平。利用免疫共沉淀检测FLT3基因的自磷酸化水平。Western Blot检测FLT3下游经典通路的磷酸化水平。利用CCK8试验和CSFE试验和克隆形成实验检测FLT3半敲除后细胞在体外的生物学效应。利用一株K562单FLT3等位基因缺失克隆和一株经过转染分选处理但无基因突变的野生型对照克隆尾静脉注射辐照后的NOD/SCID鼠建立异种移植白血病模型评估FLT3半剂量效应不足的在体生物学效应。结果成功构建针对FLT3JM区域具有切割效应的TALENs并成功获得FLT3单等位基因移码突变的K562克隆。20个最可能的基因组脱靶位点检测未能发现TLAENs的脱靶效应。FLT3单等位基因移码突变引起单倍体剂量不足效应,同时出现FLT3受体磷酸化水平的下降和下游通路AKT, ERK和STAT5信号转导分子的磷酸化水平减低。FLT3半敲除的K562克隆体外增殖减慢,克隆形成能力减弱。在K562NOD/SCID鼠异种移植白血病模型中,FLT3单倍体剂量不足效应导致发病延迟,生存率提高同时疾病表型减轻。结论通过TALENs特异破坏FLT3基因JM区序列能造成FLT3受体激酶活性的抑制。该抑制效应的机制可能是通过FLT3半倍体剂量不足效应引起的FLT3受体磷酸化水平减低和相关下游信号通路的抑制引起。通过基因组编辑技术对FLT3-ITD突变高发区JM的单等位基因敲除引起白血病细胞体外和在体的生长受抑现象可能为未来针对FLT3的靶向策略提供新的思路。