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肾脏移植做为终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)最有效的治疗手段,其临床应用一直受到肾源供体短缺的严重制约。因此,研究者们致力于在体外构建出既具有生理解剖结构又具有生物活性的人工肾脏用于ESRD的替代治疗。近年来随着再生医学研究水平与组织工程技术不断提高,越来越多的人体组织和器官被体外构建出来,有些已经应用于临床实践中,为生物人工肾脏带来了新的希望。组织工程器官的再生策略是,通过体外扩增培养种子细胞,并将其定植于具有三维结构的生物支架内,通过重建组织再生微环境,诱导细胞增殖及定向分化,逐步构建功能单元并发挥联合作用实现器官再生。然而由于肾脏结构异常复杂,并在体内发挥着过滤代谢废物、调节体液平衡及内分泌等重要功能,目前尚未有团队构建出能实现体内移植并真正发挥替代功能的组织工程肾脏。基于目前的研究水平,想要实现组织工程肾脏的生理结构和功能重建,还需要解决以下几个关键问题:(1)制备血路及尿路结构完整、富含生长因子并生物相容的支架材料;(2)确定肾脏发育机制及多种肾功能细胞的诱导分化体系;(3)体外重塑满足器官培养条件的生理微环境;(4)解决组织工程肾脏植入后的血栓形成及体内存活问题。以上是组织工程肾脏构建过程中的关键问题,只有在此基础上才能进一步探索肾脏各功能单元间相互作用机制并最终实现全器官体外重建。本研究从组织工程肾脏支架材料的制备、抗凝血修饰及再细胞化方面做了以下工作:一、对肾脏脱细胞技术条件进行了优化。首先通过文献回顾对已报道的各种肾脏脱细胞支架制备流程进行汇总分析,剔除已被证实的对细胞外基质(extracellular matrix,ECM)具有潜在危害的试剂及方法,选择聚乙二醇辛基苯基醚(polyethylene glycol octyl phenyl ether,TritonX-100)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)作为脱细胞液主体成分。然后,经过灌注条件优化及预实验摸索,设计了1%TritonX-100、0.5%SDS、0.5%SDS+1%TritonX-100等实验组,先在2 mL/min流速下使用以上三组试剂通过肾动脉对SD大鼠(Sprague Dawley rat,SD rat)的肾脏进行灌注,发现单独使用SDS可在12小时内有效脱去肾脏细胞成分,获得完全透明的脱细胞支架。单独使用SDS持续降低灌注流速,发现低至0.4 mL/min时依然可保证在12小时内获得完整透明的肾脏脱细胞支架。接着,本实验尝试对大鼠肾脏在灌注洗脱液前施加高静水压及反复冻融预处理,发现冻融和高静水压虽然能使细胞膜在灌注前发生破裂,但并不能进一步缩短化学试剂洗脱时间,反而因为水压破坏了肾脏天然结构,使得细胞碎片不能顺利随洗脱液从管腔流出,即使延长洗脱液灌注时间,也未能获得透明的细胞外基质。所以最终确定了使用单一试剂SDS、低浓度、低流速的灌注脱细胞方法。经优化工艺制备的肾脏脱细胞支架,通过苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,H&E)染色、扫描电子显微镜(scanning electron microscopy,SEM)、DNA残留量检测及ECM主要成分蛋白免疫荧光染色等方法,验证了利用此方法制备的肾脏脱细胞支架结构和功能蛋白保留完整,最大程度减少了化学试剂毒性残留和水流冲击对脉管精细结构的破坏,为进一步的研究创造了有利的条件。二、成功进行肾脏脱细胞支架的抗凝修饰。本研究将一种由十个氨基酸组成的能够特异性结合胶原蛋白的短肽——胶原连接肽段(collagen binding peptide,CQDSETRTFY,CBP)与肝素(heparin)共价合成形成CBP-Heparin化合物,然后通过灌注使CBP-Heparin结合在肾脏脱细胞ECM的胶原部分,从而对肾脏支架进行肝素化修饰。通过甲苯胺蓝染色、肝素定量及肝素释放量测试,验证了CBP-Heparin化合物能够稳定结合在ECM上。接着本研究验证了经CBP-Heparin修饰的肾脏脱细胞ECM的抗凝血能力,将分别经Heparin、CBP-Heparin修饰的肾脏脱细胞ECM和经磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)处理的对照组分别进行血液灌注实验,通过H&E染色、扫描电镜及血小板标志物CD61免疫荧光染色的结果显示,CBP-Heparin组的肾脏脱细胞ECM黏附血小板和红细胞的数量均显著减少,且能够有效地防止血栓形成。三、有效提高了肾脏脱细胞支架的再细胞化水平。本研究将体外扩增培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical venous endothelial cells,HUVECs)通过肾动脉分别灌注到经Heparin、CBP-Heparin修饰的肾脏脱细胞ECM中,在适宜细胞生长的微环境中培养7天,分别在1天、3天、7天时进行取材检测,通过微管蛋白(tubulin)及内皮细胞标志物CD31的免疫荧光染色,证明经过CBP-Heparin修饰的肾脏脱细胞ECM支架更有利于内皮细胞的粘附、迁移和生长,能够促进其再内皮化,为组织工程肾脏的脉管和功能重建创造了基础条件。综上所述,本研究通过优化肾脏脱细胞支架制备的流程及方法,利用CBP-Heparin进行全肾肝素化修饰,有效地提高了肾脏脱细胞支架的抗凝血能力和再细胞化水平,为今后进一步实现组织工程肾脏再生提供了良好的实验支撑和技术保障。