捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)属毛圆科(Trichostrongylidae)血矛属(Haemonchus)线虫,是羊(山羊、绵羊)的主要胃肠道寄生虫之一,常常导致羊特别是羔羊贫血、消瘦、甚至死亡,造成重大经济损失。对反刍兽胃肠道线虫,尤其是对捻转血矛线虫的控制至今仍停留在化学药物驱杀阶段,但是抗药性虫株的产生已经很大程度上影响了化药的效力。这已经迫使人们将注意力转移到利用免疫学方法来防治该病,尤其是疫苗的开发上。发现新的具有线虫发育调节性的或强免疫原性的基因对发展有效的捻转血矛线虫疫苗是十分必要的。本文利用cDNA末端快速扩增法(RACE)技术首次地克隆出捻转血矛线虫谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、肌撕裂蛋白(Dim-1)和脂肪酶(Lipase)三个新基因的全长cDNA序列,随后对之进行序列或重组蛋白活性的分析。根据其他研究者的报道及研究结果来看,其中GPX和Lipase都是和捻转血矛线虫发育调节相关的蛋白,Dim-1是具有强免疫原性的蛋白。最后将GPX和Dim-1构建成DNA疫苗并对山羊免疫,评估其针对捻转血矛线虫的保护效力,且对产生的保护作用的免疫机理做了初步的探究。具体工作如下：1.捻转血矛线虫HC29基因的克隆、特性分析根据已发表的mRNA部分序列的5’和3’末端设计引物,通过RACE获得了捻转血矛线虫HC29的全基因序列。HC29的cDNA序列全长为1113bp,拥有一个507bp的开放阅读框,编码一个168个氨基酸的蛋白,其预测分子量为18.9kDa。通过对氨基酸序列的分析发现,HC29拥有保守的非硒依赖型GPX的催化三联体和二聚体交联界面。将预测的蛋白氨基酸序列和硫氧还蛋白样家族的其他GPX同系物相比,拥有44.7-80.4%的相似率。进化树分析显示HC29和其他GPX同系物序列有较高的进化相似性。这些发现证明克隆出来的HC29是一个GPX蛋白,属于硫氧还蛋白样家族的一个成员。对HC29和先前报道的捻转血矛线虫的另外一个GPX的核苷酸及氨基酸序列进行比对分析发现,HC29有着不同类型的剪接前导序列和二聚体交联界面位点,但是二者的催化位点是一致的。对原核表达的重组HC29蛋白进行特异性酶活力分析,显示了降解H202的能力。这些发现都说明了HC29是一种新的捻转血矛线虫的GPX蛋白。2.捻转血矛线虫HC29 DNA疫苗的免疫保护性试验根据已经克隆的HC29序列,将其构建成DNA疫苗,并对其在山羊体内的抗捻转血矛线虫的免疫保护作用进行研究。将15只山羊随机分为三个实验组,HC29组的动物在0天和14天免疫HC29 DNA疫苗,在28天攻击5000条感染性三期幼虫；非免疫阳性对照组只在28天攻击5000条感染性三期幼虫；同时一组非免疫非攻虫动物被设立为阴性对照组。结果显示,HC29 DNA疫苗组于免疫之后在注射部位检测出HC29抗原的转录和表达。在攻虫之后,HC29组动物的每克粪便平均虫卵计数和荷虫率分别降低了36.1%和35.6%,在免疫之后,高水平的血清IgG、血清IgA和粘膜IgA被诱导产生,CD4+T淋巴细胞和B淋巴细胞增加,外周血嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数量增加,血红素水平下降。这些数据表明,重组的捻转血矛线虫HC29谷胱甘肽过氧化物酶DNA疫苗能产生针对羊血矛线虫的部分的保护作用。3.捻转血矛线虫肌撕裂蛋白(Dim-1)基因的克隆及免疫保护性试验研究由于捻转血矛线虫肌撕裂蛋白(Dim-1)对宿主免疫系统具有强烈的免疫原性,所以Dim-1有望成为一种控制吸血线虫病的良好的潜在疫苗候选基因。但是,关于Dim-1基因完整编码序列及保护能力的研究资料信息非常匮乏。在本研究中,根据已发表的mRNA部分序列的5’和3’末端设计引物,通过RACE获得了捻转血矛线虫Dim-1的全基因序列。Dim-1的cDNA序列全长为1232bp,拥有一个966bp的开放阅读框,编码一个321个氨基酸的蛋白。以HC29 DNA疫苗保护性试验相关分组及试验方法为参考,将Dim-1构建成DNA疫苗,并对其在山羊体内的抗捻转血矛线虫的免疫保护作用进行研究。结果显示,Dim-1 DNA疫苗组于免疫之后在注射部位检测出Dim-1抗原的转录和表达。在攻虫之后,Dim-1组动物的每克粪便平均虫卵计数和荷虫率分别降低了45.7%和51.1%,在免疫之后,高水平的血清IgG、血清IgA和粘膜IgA被诱导产生,CD4+T淋巴细胞和B淋巴细胞增加,外周血嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数量增加,血红素水平下降。这些数据表明,重组的捻转血矛线虫Dim-1 DNA疫苗能产生针对羊血矛线虫的部分的保护作用。4.捻转血矛线虫脂肪酶(Lipase)基因的克隆与特性分析寄生虫生活周期相关的基因被认为是在发展替代控制策略方面具有良好的潜力。捻转血矛线虫脂肪酶(Lipase)对此寄生虫的多个发育阶段中的多项生命活动都具有重要的生物学意义,有望成为一种控制吸血线虫病的良好的潜在疫苗候选基因或者药物标靶。本篇试验研究中,使用cDNA末端快速扩增法(RACE)获得了捻转血矛线虫Lipase的全基因序列,并将序列登陆至GenBank (登录号：HQ444390)。Lipase的cDNA序列全长为1121bp,拥有一个918 bp的开放阅读框,编码一个305个氨基酸的蛋白。对其进行蛋白结构分析预测,显示捻转血矛线虫Lipase具有一个脂肪酶催化三联体激活位点,一个“盖子(lid)”结构,一个“亲核弯(nucleophilic elbow)",一爪信号肽结构区域。