背景与目的:当B淋巴细胞发育、分化、功能异常时,可产生自身抗体攻击宿主细胞,而自身反应性B淋巴细胞在体内长期存在,导致B淋巴细胞免疫失能的中断,而长期处于活化状态,将导致自身免疫紊乱,与自身免疫性疾病的发生密切相关。为了阻止自身反应性B淋巴细胞活化以及最终产生免疫反应,在中枢和外周免疫耐受过程中,机体可通过BCR识别自身抗原,通过克隆清除自身反应性B淋巴细胞、对自身反应性BCR受体编辑或介导B淋巴细胞免疫失能。但是,导致自身反应性B淋巴细胞的发生机制尚未明确,是亟待解决的重要问题。目前国内外研究已经表明,泛素化与去泛素化之间的平衡,是维持T淋巴细胞免疫失能、阻止自身免疫发生的重要机制。E3泛素化连接酶成员已被证实,是介导T淋巴细胞免疫失能的重要分子。Grail（Gene Related Anergy In Lymphocyte,RNF128）,淋巴细胞失能相关基因,又称为RNF128,是一种新型的泛素蛋白连接酶,经过多年研究已证实,Grail能够抑制naive CD4+T淋巴细胞分化、增殖与活化,抑制抗原提呈功能介导CD4+和CD8+T淋巴细胞免疫耐受;Grail与多种自身免疫性疾病的发生密切相关,例如自身免疫性关节炎、溃疡性结肠炎,哮喘等。但是,目前对于调控B淋巴细胞免疫耐受机制的认识有限,尚无Grail与B淋巴细胞免疫耐受相关研究报道。因此,本研究目的在于明确E3泛素化连接酶Grail是否介导B淋巴细胞免疫耐受、探索Grail介导B淋巴细胞免疫耐受的具体机制、通过建立小鼠类风湿关节炎疾病模型进一步确证Grail对B淋巴细胞活化与免疫耐受的调控作用,从而为明确自身免疫性疾病的发病机制、探讨新的治疗靶点奠定坚实的理论基础。方法:1.检测Grail在B淋巴细胞中的表达:Western Blot方法检测Grail在健康人群、WT小鼠B淋巴细胞中的蛋白表达。2.分析Grail对B淋巴细胞发育的影响:利用骨髓嵌合鼠μMT/TCRβ-/-、μMT/TCRβ-/-Grail-/-,比较两种小鼠骨髓与脾脏中B淋巴细胞发育情况。3.分析Grail对B淋巴细胞活化的作用:在anti-IgM、anti-CD40及IL4活化WT小鼠B淋巴细胞后,以及应用DNP-Ficoll免疫WT小鼠与Grail KO小鼠后,检测Grail蛋白与B淋巴细胞表面活化分子表达。4.分析Grail对B淋巴细胞抗原提呈功能的影响:利用骨髓嵌合鼠,通过“T细胞非依赖性”与“T细胞依赖性”B淋巴细胞体内活化模型,分析血清特异性IgG、IgM、生发中心形成情况以及生发中心B淋巴细胞比例;体外进行辅助性T淋巴细胞分化实验,流式细胞仪检测各辅助性T淋巴细胞亚群比例。5.Grail与B淋巴细胞免疫失能:利用转基因免疫失能Ars/A1小鼠及WT小鼠,Western Blot及QRT-PCR方法分析Grail蛋白表达;将转基因免疫失能IgHELs HEL小鼠敲除Grail基因,比较未成熟B淋巴细胞与滤泡B淋巴细胞比例,同时检测血清特异性IgM水平,明确B淋巴细胞效应功能的变化。6.Grail对B淋巴细胞增殖、活化作用:活化WT与Grail KO小鼠B淋巴细胞,通过3H-Thymidine掺入检测B淋巴细胞增殖,流式细胞仪分析B淋巴细胞表面活化分子表达;明确Grail通过BCR信息通路调控B淋巴细胞增殖与活化。7.Grail对BCR信息通路调控作用:活化WT与Grail KO小鼠B淋巴细胞,Western Blot检测主要BCR信号分子蛋白表达与磷酸化蛋白表达、进行anti-Ub（K48）泛素化分析,明确Grail调控BCR信息通路分子机制。8.调控Grail表达信息通路:通过mTOR信号抑制剂与PTEN诱导剂抑制mTOR信息通路,分析WT小鼠与健康人B淋巴细胞Grail蛋白、mTOR信息通路下游分子S6磷酸化蛋白表达;活化WT与Grail KO小鼠B淋巴细胞,检测mTOR、Akt蛋白与磷酸化蛋白表达;同时检测PTEN蛋白与泛素化蛋白表达。9.建立类风湿关节炎疾病模型,证实Grail抑制B淋巴细胞活化与效应功能,介导B淋巴细胞免疫耐受。利用CII/CFA诱导μMT/C57BL/6小鼠、μMT/Grail-/-小鼠产生类风湿关节炎,进行关节炎数字评分,分析B淋巴细胞亚群、血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgG2c水平。结果:1.Grail表达于野生型小鼠和人B淋巴细胞。WT小鼠和健康人B淋巴细胞均表达Grail蛋白,活化B淋巴细胞后,Grail蛋白表达增加。2.Grail不影响B淋巴细胞发育。与未敲除Grail基因的小鼠相比较,Grail KO小鼠骨髓以及脾脏中,Immature、mature、pro-B、pre-B、过渡型B淋巴细胞（T1、T2、T3）、边缘区、滤泡B淋巴细胞等各种B淋巴细胞亚群比例无显著差异。3.Grail抑制B淋巴细胞活化。流式细胞仪分析结果显示:活化Grail KO小鼠B淋巴细胞后,表面活化分子CD80、CD86、CD40表达水平均高于WT小鼠（P＜0.01）,表明Grail抑制B淋巴细胞活化。4.Grail抑制B淋巴细胞抗原提呈功能。通过DNP-Ficoll、KLH/CFA免疫后,Grail KO小鼠产生更多的特异性免疫球蛋白IgG、IgM;生发中心数量增多;生发中心B淋巴细胞明显增多（p＜0.01）;在体外辅助性T淋巴细胞分化试验中,Grail KO小鼠B淋巴细胞促进naive CD4+T淋巴细胞分化为更多的TH1、TH2、TH17及TFH淋巴细胞（P＜0.01）,体内外研究均证实Grail抑制B淋巴细胞抗原提呈功能。5.Grail与B淋巴细胞免疫失能相关。Western Blot结果显示免疫失能转基因Ars/A1小鼠中,免疫失能T3型B淋巴细胞增多,Grail蛋白表达增高;T3型B淋巴细胞中Grail mRNA表达增高;将免疫失能转基因小鼠IgHELs HEL敲除Grail基因后,FO B淋巴细胞比例增加;此外,Grail KO小鼠血清中抗原特异性的IgM显著升高（P＜0.01）,表明Grail与B淋巴细胞免疫失能相关;Grail表达缺失时促进B淋巴细胞效应功能恢复。6.Grail通过BCR信息通路抑制B淋巴细胞增殖、活化。在antiIgM活化B淋巴细胞后,Grail KO小鼠B淋巴细胞增殖活性强于WT小鼠,而在IL-4、anti-CD40活化下,二者B淋巴细胞增殖活性无差异;Grail KO小鼠B淋巴细胞活化标志CD80（P＜0.01）、CD86（P＜0.01）、ICOSL（P＜0.05）表达水平高于WT小鼠;表明Grail通过BCR信号通路调控B淋巴细胞增殖与活化。7.Grail泛素化BCR信息通路主要分子,介导B淋巴细胞免疫耐受。Western Blot结果显示,与WT小鼠比较,Grail KO小鼠B淋巴细胞中,多种主要BCR信号分子,包括:Igα、PLcγ2、NFATC1、PI3k、Akt、mTOR蛋白表达增加,而Igα、Akt、PLcγ2、PI3K磷酸化蛋白表达增加;泛素化分析显示,Grail KO小鼠Igα、Akt、PI3K、PLcγ2泛素化的弥散条带弱于WT小鼠,表明Grail通过泛素Igα、Akt、PI3K、PLcγ2主要BCR信号分子,抑制B淋巴细胞活化与效应功能,介导免疫耐受。8.PTEN、mTOR信息通路调控Grail表达。通过mTOR信号抑制剂Rapamycin处理后,WT小鼠与健康人B淋巴细胞Grail蛋白较对照组表达增加,下游磷酸化蛋白p S6在健康人表达减低,野生小鼠不表达,表明mTOR信号通路调控Grail蛋白表达,并呈负向相关。将人B淋巴细胞Raji细胞株,敲除PTEN,再给予PTEN诱导剂Doxycycline处理后,与对照组相比,诱导PTEN表达后Grail蛋白表达增加,并随孵育时间延长表达增强。mTOR信号通路下游磷酸化蛋白p S6表达明显降低。此外,Grail KO小鼠B淋巴细胞PTEN蛋白表达减低,Akt及mTOR磷酸化蛋白表达增加。均证实PTEN抑制mTOR信号通路促进Grail表达,同时表明Grail与PTEN可能具有协同作用。但Grail KO与WT小鼠,PTEN泛素化蛋白K48弥散带无明显差别,二者之间具体协同作用机制需进一步探讨。9.Grail在体内介导B淋巴细胞免疫耐受,减低类风湿关节炎的发病风险。与WT小鼠相比,Grail KO小鼠表现为更加严重的关节炎,生发中心B细胞（P＜0.01）、TFH细胞比例升高（P＜0.01）,而Treg细胞比例减低（P＜0.01）,血清中IgM、IgG、IgG2c均增高。证实Grail通过介导B淋巴细胞免疫耐受而抑制类风湿关节炎的发生。结论:1.E3泛素连接酶Grail表达于野生型小鼠和健康人B淋巴细胞,Grail不影响B淋巴细胞发育,但能够抑制B淋巴细胞活化及抗原提呈功能。2.Grail与B淋巴细胞免疫失能有关,Grail表达缺失时中断B淋巴细胞免疫失能,促进B淋巴细胞效应功能恢复。3.Grail负性调控BCR信号通路,通过K48蛋白泛素化主要BCR信号分子,抑制B淋巴细胞活化与效应功能,介导B淋巴细胞免疫耐受;在类风湿关节炎小鼠模型中证实,Grail通过介导B淋巴细胞免疫耐受减低类风湿关节炎发病风险。4.PTEN通过负性调节AKT/mTOR信号通路促进Grail在B淋巴细胞中的表达,Grail可能与PTEN具有协同作用,但具体机制仍需深入探索。