研究背景及目的:结直肠癌(colorectal carcinoma,CRC)是人类第二大常见的恶性肿瘤,在全球范围内,其患病率占总人口 9.7%。尽管自1990年以来结直肠癌死亡率以每年约3%的速度逐步下降,但它仍然是第三位的癌症死亡原因,给社会发展及人类的生命健康带来了极大的威胁。在我国,随着国民经济发展和居民饮食结构的改变,结直肠癌发病率在所有癌症发病率中居第三位,且呈逐渐上升的趋势。目前,临床上对结直肠癌的治疗主要是以手术为主的综合治疗,虽经过多年的艰苦探索,但临床疗效并无显著改善,结直肠癌患者最终不可避免地出现肿瘤复发和转移,患者5年生存率未见明显提高。因此,寻找新的结直肠癌早期诊断标志物、阐明结直肠癌发生发展的分子机制、鉴定新的治疗靶点是抑制结直肠癌肿瘤演进、降低复发和死亡率的关键。恶性肿瘤的发生是一个多因素作用、多基因参与并经过多个阶段才最终形成的极其复杂的生物学现象。以往的肿瘤相关基因研究一直集中于编码蛋白基因,然而随着高通量测序等技术的不断发展和完善,大量长片段的非编码RNA被人们所发掘,它们在生命活动中的重要意义也逐渐得到揭示,为研究肿瘤相关新基因提供了一个新的视角和重要源泉,并已成为研究的热点。LncRNAs是一类转录本长度超过200 nt,不具有完整的开放阅读框不能编码蛋白的RNA分子。研究发现LncRNAs参与了包括染色体沉默、基因组印迹、染色质修饰、转录激活、转录后调控、蛋白质功能调节等多种十分重要的生命活动调控过程,并且在多种人类肿瘤的发生发展中扮演着极其重要的角色。本课题组前期收集不伴有淋巴结转移、伴有淋巴结转移的结直肠癌组织及正常肠粘膜组织进行LncRNAs差异表达谱分析,挖掘出一簇在结直肠癌组织中差异表达的LncRNAs;其中LncRNA SATB2-AS1(以下简称SATB2-AS1)在结直肠癌组织中表达明显低于正常肠粘膜组织,提示SATB2-AS1表达异常可能与结直肠癌密切相关,然而其确切的生物学功能及作用机制尚不明确。本研究旨在探讨SATB2-AS1在结直肠癌发生发展中的作用及其可能的机制,进而为结直肠癌早期诊断和治疗提供新的策略,具有重要的科学意义和临床应用价值。方法:1.采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法检测了 50对结直肠癌及其配对正常粘膜组织以及结直肠癌细胞株和正常肠上皮细胞株中SATB2-AS1表达的情况。2.采用慢病毒感染方法构建稳定过表达SATB2-AS1的结直肠癌细胞株和对照细胞株;采用CCK-8实验、平板克隆实验检测细胞的体外增殖能力,流式细胞术分析其细胞周期的改变;划痕实验和Transwell实验检测细胞体外迁移能力;裸鼠皮下成瘤实验观察肿瘤细胞在裸鼠体内成瘤能力。3.采用RNAi的方法有效沉默SATB2-AS1的表达,利用体外功能实验观察结直肠癌细胞的生物学功能变化。4.检测结直肠癌组织中SATB2的表达水平,并分析其与SATB2-AS1的相关性;检测SATB2-AS1过表达的结直肠癌细胞中SATB2 mRNA的表达水平,观察SATB2-AS1对SATB2的调控效应。5.生物信息学分析并结合RNA免疫沉淀(RNA Immunoprecipitation,RIP)及RNA pull down技术鉴定与SATB2-AS1相互结合的表观遗传修饰物,并观察SATB2-AS1以及表观遗传修饰物对SATB2的调控效应。6.人工干预表观遗传修饰物及SATB2表达,进行功能实验,观察二者变化对SATB2-AS1作用的逆转效应。结果:1.SATB2-AS1在结直肠癌组织及细胞株中的表达检测利用Real-time PCR方法检测9株结直肠癌细胞、正常肠黏膜上皮细胞和50对结直肠癌及配对正常结直肠粘膜组织中SATB2-AS1的表达情况,结果显示SATB2-AS1在9株结直肠癌细胞株中的表达水平明显低于正常对照细胞;在癌组织中其表达水平也明显低于配对正常组织(P<0.001),且在伴有淋巴结转移的结直肠癌组织中其表达水平低于不伴有淋巴结转移癌组织(P=0.026)。2.过表达SATB2-AS1对结直肠癌细胞生物学功能的影响;利用慢病毒感染的方法把带有外源性SATB2-AS1的载体及空载体病毒上清液分别感染LOVO及M5细胞,利用流式细胞术分选及表达水平鉴定,成功构建稳定过表达 SATB2-AS1 的细胞株(LOVO/SATB2-AS1,M5/SATB2-AS1)及对照细胞株(LOVO/MOCK,M5/MOCK),而后进行体内外功能实验。CCK-8增殖实验结果显示:与对照细胞相比,LOVO/SATB2-AS1及M5/SATB2-AS1细胞的增殖能力明显下降,差异有统计学意义(FLOVO=43.135,P<0.0001;FM5=61.586,P<0.0001);平板克隆实验结果显示:与对照细胞相比,过表达SATB2-AS1后,LOVO和M5细胞克隆形成能力明显降低(tLOVO=14.00,PLOVO=0.0002;t M5=3.675,PM5=0.0213);流式细胞学分析细胞周期的改变,结果显示,过表达SATB2-AS1后,LOVO及M5细胞G1期细胞比例明显增多(tLOVO=31.14,PLOVO<0.0001;tM5=3.14,PM5=0.0348);划痕迁移实验:过表达SATB2-AS1后,LOVO及M5细胞的迁移能力显著下调(tLOVO=7.106,PLOVO=0.0001;tM5=5.494,PM5=0.0006);transwell侵袭实验:过表达SATB2-AS1减少LOVO及M5细胞穿过聚碳酸酯膜数(tLOVO=11.13,PLOVO=0.0004;tM5=7.684,P M5=0.0015);裸鼠皮下成瘤实验:结果显示,过表达SATB2-AS1细胞组裸鼠皮下瘤的生长速度明显低于对照组(F=13.707,P=0.01),且Ki-67的阳性率明显低于对照组(t=14.60,P=0.0001)。3.抑制SATB2-AS1的表达对结直肠癌细胞的生物学行为的影响利用RNAi技术在结直肠癌细胞株SW480中有效沉默SATB2-AS1的表达,并获得细胞株SW480/Si以及对照组细胞株SW480/NC,并进行体外功能实验。CCK-8增殖实验结果显示:与对照细胞相比,SW480/Si细胞的增殖能力明显增强,差异有统计学意义(F=7.671,PSW480=0.009)。平板克隆实验结果显示:与对照细胞相比,沉默SATB2-AS1的表达后,SW480细胞克隆形成能力明显增强(tSW480=3.452,PSW480=0.0260)。流式细胞学分析其细胞周期的改变,结果显示,沉默SATB2-AS1的表达后,SW480细胞G1期比例明显减少(tSW480=4.281,P SW480=0.0128)。划痕迁移实验:沉默SATB2-AS1的表达后,SW480细胞的迁移距离显著增加(tSW480=2.228,PSW480=0.0405)。transwell侵袭实验:沉默SATB2-AS1的表达增加SW480细胞穿过聚碳酸酯膜数目(tSW480=4.217,PSW480=0.0056)。4.SATB2-AS1与SATB2表达相关性通过Real-Time PCR检测结直肠癌组织中SATB2-AS1和SATB2表达关系,发现二者表达量呈正相关(r2=0.3123,P<0.0001)。过表达SATB2-AS1后,LOVO 和 M5 细胞中 SATB2 mRNA 表达水平上调(tLOVO=15.03,P LOVO=0.0001;tM5=11.62,PM5=0.003),SATB2蛋白表达水平亦上调。结果表明SATB2-AS1可正向调控SATB2mRNA及蛋白的表达。5.SATB2-AS1调控SATB2表达的分子机制5.1 SATB2-AS1不增加SATB2的稳定性RNA合成阻滞实验观察SATB2-AS1过表达对SATB2 mRNA稳定性的影响,结果显示结直肠癌细胞中外源性过表达SATB2-AS1后SATB2mRNA的半衰期并没有发生显著变化(F=3.192,P=0.091)。5.2 SATB2-AS1能与乙酰转移酶p300相互结合,但不改变其表达水平通过生物信息学分析发现SATB2-AS1与SATB2互补序列附近(即两者转录SATB2转录起始附近)存在转录活性及相应的组蛋白修饰,特别是具有活化基因表达功能相关的组蛋白H3第9位赖氨酸乙酰化(H3K9ac)、组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化(H3K27ac)、组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化(H3K4me3)。通过RNA-IP及RNA-pulldown实验证实SATB2-AS1能与乙酰转移酶p300相互结合。但是过表达SATB2-AS1并不能引起p300的表达变化。5.3过表达SATB2-AS1调控组蛋白乙酰化水平促进SATB2转录利用Western blot实验检测SATB2-AS1对组蛋白H3K9、H3K27乙酰化水平、H3K4甲基化水平的影响,结果显示过表达SATB2-AS1能够促进组蛋白H3K9、H3K27位点乙酰化以及SATB2的表达,而对H3K4me3水平无明显影响。5.4 SATB2的表达受乙酰化水平调控利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古柳菌素(TrichostatinA,TSA)和组蛋白乙酰转移酶抑制剂C646处理结直肠癌细胞观察SATB2的表达变化,结果显示,采用TSA处理后与过表达SATB2-AS1一样,均能促进SATB2 mRNA的表达(tSATB2-AS1=3.121,PSATB2-AS1=0.0355;tTSA=2.918,PTSA=0.0433),而SATB2-AS1促进SATB2的表达能够被C646所逆转(tC646=5.565,PC646=0.0051)。在蛋白水平,获得同样结果。5.5抑制p300或SATB2表达可回复SATB2-AS1过表达的功能在稳定过表达SATB2-AS1的结直肠癌细胞中沉默p300或SATB2表达,观察p300和SATB2在SATB2-AS1发挥功能中所扮演的角色。体外功能结果显示:CCK-8增殖实验结果显示:过表达细胞株LOVO/SATB2-AS1及M5/SATB2-AS1相对于对照组细胞株其增殖能力显著下降(FLOVO/SATB2-AS1=24.035,PLOVO/SATB2-AS1<0.000 1;PM5/SATB2-AS1=9.260,PM5/SATB2-AS1=0.004),而在此基础上敲低p300或SATB2的表达后能够使细胞增殖能力增强(FLOVO/SATB2-AS1/Sip300=121.734,PLOVO/SATB2-AS1/Sip300<0.0001;FLOVO/SATB2-AS1/SiSATB2=4.65 3,PLOVO/SATB2-AS1/SiSAB2=0.0096;FM 5/SATB2-AS 1/Sip300=93.461,P M5/SATB2-AS1/Sip300<0.0001;F M5/SATB2-AS1/SiSATB2=10.138,P M5/SATB2-AS1/SiSATB2=0.0 1 3)。平板克隆实验结果显示:与对照细胞相比,过表达SATB2-AS1后,LOVO和M5细胞克隆形成能力明显降低(tLOVO/SATB2-AS1=5.339,P LOVO/SATB2-AS1=0.0059;t M5/SATB2-AS1=6.841,PM5/SATB2-AS1=0.0024);而在此基础上敲低 p300或SATB2的表达后能够使细胞克隆形成能力增强(t LOVO/SATB2-AS1/Sip300=8.948,PLOVO/SATB2-AS1/Sip300=0.0009;tLOVO/SATB2-AS1/SiSATB2=4.653,PLOVO/SATB2-AS1/SiSAB2=0.0096;tM5/SATB2-AS1/Sip300=6.841,PM5/SATB2-AS1/Sip300=0.0024;t M5/SATB2-AS1/SiSATB2= 12.56,P M5/SATB2-AS1/SiSATB2=0.0002)。流式细胞学分析其细胞周期的改变,结果显示,过表达SATB2-AS1后,LOVO及M5细胞G1期比例明显升高(tLOVO=31.14,PLOVO<0.0001;tM5=3.14,PM5=0.0348);而在此基础上敲低p300或SATB2的表达后能够使G1期细胞比例得到部分回复(tLOVO/SATB2-AS1/Sip300=7.543,PLOVO/SATB2-AS1/Sip300=0.0017;tLOVO/SATB2-AS1/SiSATB2=12.41,PLOVO/SATB2-AS1/SiSATB2=0.0002;tM5/SATB2-AS1/Sip300=21.06,P M5/SATB2-AS1/Sip300<0.0001;t M5/SATB2-AS1/SiSATB2=5.823,P M5/SATB2-AS1/SiSATB2=0.0043)。划痕迁移实验:过表达SATB2-AS1后,LOVO及M5细胞的迁移能力显著下调(tLOVO=9.790,PLOVO=0.0006;t M5=9.915,PM5=0.0006);而在此基础上敲低p300或SATB2的表达后能够使细胞迁移能力增强(t LOVO/SATB2-AS1/Sip300=6.946,PLOVO/SATB2-AS1/Sip300=0.0023;tLOVO/SATB2-AS1/SiSATB2=4.654,PLOVO/SATB2-AS1/SiSATB2=0.0096;tM5/SATB2-AS1/Sip300=20.95,P M5/SATB2-AS1/Sip300<0.0001;t M5/SATB2-AS1/SiSATB2=15.17,P M5/SATB2-AS1/SiSATB2=0.0001)。Transwell侵袭实验:过表达SATB2-AS1减少LOVO及M5细胞穿过聚碳酸酯膜数(tLOVO=8.523,PLOVO=0.0010;t M5=17.49,PM5<0.0001);而在此基础上敲低p300或SATB2的表达后能够使穿过聚碳酸酯膜数目增多(t LOVO/SATB2-AS1/Sip300=1 2.19,PLOVO/SATB2-AS1/Sip300=0.0003;tLOVO/SATB2-AS1/SiSATB2=6.603,PLOVO/SATB2-AS1/SiSATB2=0.0037;tM5/SATB2-AS1/Sip300=25.36,PM5/SATB2-AS1/Sip300<0.0001;tM5/SATB2-AS1/SiSATB2=14.50,PM5/SATB2-AS1/SiSATB2<0.0001)。以上实验结果均证实SATB2-AS1能通过募集乙酰转移酶p300使SATB2转录起始部位组蛋白位点H3K9、H3K27乙酰化,促进SATB2的表达,从而在结直肠癌中发挥其生物功能。结论:1.SATB2-AS1在结直肠癌组织和细胞中呈低表达状态;2.SATB2-AS1低表达能够促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力;3.SATB2-AS1与其正义链基因SATB2表达呈正相关,并能够促进其表达;4.SATB2-AS1通过募集乙酰转移酶p300使组蛋白H3K9及H3K27乙酰化水平增高进而促进SATB2的转录;5.SATB2-AS1通过表观遗传学调控SATB2表达共同参与结直肠癌发生发展。