研究背景胃癌是恶性程度较高的消化道实体肿瘤,是世界上第四大常见的恶性肿瘤。在全球范围内,每年约有93万的胃癌新发病例,其中73万患者最终死亡,胃癌是一种致死率极高的恶性肿瘤。研究发现超过一半的新病例发生在发展中国家,东亚,东欧,中美洲和南美洲等是高风险地区,特别是在东亚国家,如中国、日本和新加坡。目前,只有日本的胃癌患者具有较高的五年生存率,可高达90%左右,然而,在其他国家胃癌患者五年生存率仅为10%-30%,出现这些差异主要是,日本胃癌患者早期诊断率高,与其早期通过内窥镜发现肿瘤,并且进行早期切除治疗有关。由于胃癌患者早期无明显的临床症状,同时缺乏早期的诊断标志物,在我国及其他大部分发展中国家,大多数的胃癌患者发现肿瘤时即为晚期,患者往往出现了肿瘤的远端转移和侵袭,失去了手术切除肿瘤的可能。此外,胃癌患者对化疗药物的存在着多重耐药,使患者五年生存率低、预后不佳。因此,对胃癌发生、发展的具体分子机制进行探究,有望为胃癌患者的早期诊断、治疗及预后判断提供新的方向,对胃癌患者的生存有着重大意义。研究目的本课题旨在观察mi R-374b-5p在胃癌患者癌组织及血清中表达水平,评估其作为胃癌诊断标志物特异性及其对患者预后生存时间的可能性,探讨mi R-374b-5p的下游靶基因,并分析mi R-374b-5p及其靶基因对胃癌细胞侵袭的影响。本课题主要研究以下几个问题:(1)检测胃癌患者癌组织及癌旁mi R-374b-5p表达水平,分析胃癌患者癌组织mi R-374b-5p表达水平与临床病理资料的关系;(2)检测胃癌患者及健康对照血清中mi R-374b-5p表达水平,分析血清mi R-374b-5p对胃癌患者的诊断及生存时间的预判;(3)通过生物信息学软件预测mi R-374b-5p的靶基因,并通过内源性基因、蛋白水平及外源性荧光素酶实验进行验证;(4)分别观察mi R-374b-5p及其靶基因对胃癌细胞迁移及侵袭的影响。材料与方法(1)本课题纳入的60例胃癌患者,均选自郑州大学第一附属医院胃肠外科2011年至2013年住院手术患者,所有患者术前未接受放、化疗,并取得全部患者的知情同意,其中男性30例,女性30例,平均年龄为41.6岁。分别收集60例胃癌患者的癌组织及癌周边的正常组织,并通过病理确诊证实。此外,挑选60名健康对照(男性30例,女性30例,平均年龄为42.5岁),胃癌患者与健康对照分别抽取3-5 ml外周血,其中胃癌患者与健康对照组性别及年龄无统计学差异。通过q RT-PCR分别检测胃癌患者的癌组织与癌旁组织、胃癌患者及健康对照血清中mi R-374b-5p表达水平。利用卡方χ2检验探讨胃癌患者mi R-374b-5p表达水平与临床病理资料的关系,通过受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)观察血清mi R-374b-5p作为胃癌诊断标志物的特异性和敏感度,采用乘积极限法曲线(Kaplan Meier survival curve,Kaplan-Meier)分析血清mi R-374b-5p对胃癌患者总体生存时间的评估。(2)通过mi Randa与Target Scan等mi RNA预测网站,预测mi R-374b-5p的靶基因,将mi Randa与Target Scan预测的结果选取共同有交集的部分,后续通过PANTHER分析软件进行系统分类,最终选取了和本课题相关的侵袭、运动有关的分类,将这里靶基因选出来,通过Cytoscape软件对靶基因网络进行作图,综合Targetscan预测值,最终选定mi R-374b-5p的下游靶基因;通过外源性荧光素酶及内源性q RT-PCR及Western Blot依次验证mi R-374b-5p的靶基因。(3)在细胞层面通过q RT-PCR再次验证mi R-374b-5p在胃癌细胞系中的表达水平,采用MTT细胞增殖实验、划痕实验和Transwell实验分别观察mi R-374b-5p及其靶基因对胃癌细胞增殖及侵袭的影响,进一步证实mi R-374b-5p/靶基因对胃癌侵袭的影响。研究结果(1)mi R-374b-5p在胃癌患者癌组织及血清中的表达水平及临床意义通过q RT-PCR检测胃癌患者癌组织及癌旁组织中mi R-374b-5p的表达水平,结果显示,相对于癌旁组织,胃癌患者癌组织mi R-374b-5p表达水平显著提高,进一步研究分析胃癌患者癌组织mi R-374b-5p表达水平与患者临床病理资料,结果发现,胃癌患者癌组织mi R-374b-5p表达水平与肿瘤分期及胃癌患者发生转移密切相关;通过q RT-PCR检测胃癌患者及健康对照血清中mi R-374b-5p的表达水平,结果显示,相对于健康对照,胃癌患者血清中mi R-374b-5p表达水平显著提高,通过绘制ROC曲线结果发现,ROC曲线下的面积(Area under curve,AUC)为0.81,血清mi R-374b-5p作为诊断胃癌的生物标志物具有74.69%的特异性,与73.8%的敏感度;Kaplan-Meier生存曲线分析结果发现,血清低表达mi R-374b-5p的胃癌患者生存时间显著高于血清高表达mi R-374b-5p的胃癌患者。(2)mi R-374b-5p靶基因预测与内外源性验证选取Targetscan和mi Randa靶基因预测的数据库,分析预测mi R-374b-5p的靶基因,将预测结果进行整合取相同的部分,得到大量的靶基因。为了便于筛选分析,我们进一步采用PANTHER基因功能的聚类系统将两个数据库预测的共同部分进行分析聚类,采用Cytoscape软件网络可视化了mi R-374b-5p与其相关的靶基因之间的关系,综合Targetscan预测值,选取NCKAP1作为mi R-374b-5p的下游靶基因进一步研究;通过荧光素酶实验发现mi R-374b-5p可负向调控NCKAP1,通过q RT-PCR及Western Blot实验发现上调mi R-374b-5p抑制NCKAP1的m RNA及蛋白表达水平,而下调mi R-374b-5p促进NCKAP1的m RNA及蛋白表达水平。(3)mi R-374b-5p/NCKAP1对胃癌细胞侵袭的影响及机制研究在细胞水平通过q RT-PCR检测再次验证mi R-374b-5p在胃癌细胞系中表达水平上调,在胃癌细胞系中上调mi R-374b-5p表达水平可促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭,下调mi R-374b-5p可显著抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭;上调NCKAP1抑制胃癌细胞增殖与侵袭,下调NCKAP1表达则促进胃癌细胞增殖与侵袭;干扰NCKAP1可逆转下调mi R-374b-5p对胃癌细胞侵袭的抑制作用,提示mi R-374b-5p/NCKAP1参与胃癌细胞的侵袭。结论(1)mi R-374b-5p在胃癌患者癌组织表达水平升高,发生转移的胃癌患者癌组织mi R-374b-5p表达水平高于未发生转移的患者。胃癌患者血清mi R-374b-5p表达水平显著提高,是潜在的胃癌早期诊断的生物标志物,具有较高特异性和敏感度,血清mi R-374b-5p高表达的胃癌患者生存时间显著低于血清低表达mi R-374b-5p胃癌患者,提示血清mi R-374b-5p表达水平越高患者的总体生存时间越短。(2)上调mi R-374b-5p抑制NCKAP1的m RNA及蛋白表达水平,而下调mi R-374b-5p促进NCKAP1的m RNA及蛋白表达水平,NCKAP1是mi R-374b-5p的靶基因。(3)胃癌细胞上调mi R-374b-5p促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭,下调mi R-374b-5p可显著抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭;上调NCKAP1抑制胃癌细胞增殖与侵袭,干扰NCKAP1表达则促进胃癌细胞增殖与侵袭;干扰NCKAP1可逆转下调mi R-374b-5p对胃癌细胞侵袭的抑制作用,提示mi R-374b-5p/NCKAP1参与胃癌细胞的侵袭。