论文部分内容阅读
原发性肝细胞癌是一种常见的、受多因素影响的、涉及多基因的恶性肿瘤,其发生和发展经历了一系列遗传学上的变化,因此肝癌相关新基因的寻找及功能研究对阐明肝癌的发生、发展机理具有重要意义。 为获得肿瘤相关基因,上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室采用以细胞生长为基础的功能筛选方法,获得了 300 多条促进或抑制肿瘤细胞生长的新基因,与酵母长寿基因 LAG1 同源的人类新基因 LASS2 (Homo sapiensLAG1 longevity assurance 2-like protein)就是其中之一。 通过 SMART 软件,发现 LASS2 具有 HOX、TLC 两个功能域。HOX 对神经酰胺的合成是必需的,在实验中已证实包涵 HOX 功能域的人 LAG1 同源体(与 LASS2显著同源)可以显著诱导神经酰胺合成酶的活性,而缺乏 HOX 的序列则对神经酰胺合成酶的活性无明显诱导作用。而 TLC 功能域(SMART 登录号:SM00724)——TRAM, LAG1 and CLN8 同源性功能域,其包含至少 5 个穿膜 α-螺旋。Lag1p与 Lac1p 是乙酰辅酶 A(acyl-CoA)依赖性神经酰胺合成的过程中不可或缺的。 经过 NCBI 的 Blastn 比较,发现 LASS2 与 TMSG1 一致。在将二者的 ORF、氨基酸序列进行对齐分析后发现,TMSG1 应当是 LASS2 的一个片段。TMSG1( Homosapiens tumor metastasis-suppressor)在前列腺癌细胞系 PC-3M 不转移亚系2B4 高表达,而在高转移亚系 1E8 低表达,而且 TMSG-1 基因表达水平的降低与肿瘤转移潜能的提高具有相关性。 通过 RT-PCR 实验,检测了 A-375、SCI-375、HCC97-L、HCCLM3 等肿瘤细胞系中 LASS2 的表达情况,发现 LASS2 在高转移肿瘤细胞中 SCI-375、HCCLM3 低表达,而在低转移肿瘤细胞中 A-375、HCC97-L 高表达。通过 Northern blot,验证了 LASS2 在各肿瘤细胞及正常肝组织中的表达情况,结果得到证实。同时,其在正常肝组织中高表达,在各肿瘤细胞中低表达。LASS2 在正常肝组织及各种肿瘤细胞系中的差异性表达,提示 LASS2 不仅与肿瘤的发生相关,而且可能与肿瘤的转移相关。 通过克隆形成实验、细胞生长曲线的绘制,以及裸鼠成瘤实验,均显示LASS2的异位表达对肿瘤的生长具有抑制作用。通过流式细胞仪检测,与空载体(pCMV-HA2)稳定转染的HCCLM3细胞和未经任何处理的HCCLM3细胞相比,稳定表达 LASS2 基因的 HCCLM3 细胞在凋亡方面略有提高,而在 G0/G1 期所占比例却明显提高。基因 LASS2 对肿瘤生长的抑制可能与神经酰胺相关。 为明确基因 LASS2 与肿瘤的转移之间的关系,使用了稳定表达 LASS2 蛋白 广西医科大学肿瘤专业 硕士研究生论文 3<WP=6>人源性长寿保障基因 LASS2 的功能研究的 SCI-375 混合克隆细胞系进行肿瘤转移的动物实验。通过免疫组化、WesternBolt 检测后发现,在原发瘤可以检测到 LASS2 蛋白的表达,而在肺组织的同样位置并未检测到 LASS2 的蛋白表达。因此,认为表达 LASS2 蛋白的 SCI-375 细胞并未转移到肺组织,转移到肺组织的是仅表达 G418 抗性、而不表达 LASS2 蛋白的 SCI-375 细胞。而使用稳定表达 LASS2 蛋白的 HCCLM3 细胞单克隆来进行的肿瘤转移动物实验时,发现在空载体组与基因 LASS2 组中均出现了肿瘤的肝内转移,以及肺转移,但空载体组的转移情况更严重。 LASS2 与 VPL 的相互结合,基因 VPL 在高转移肿瘤细胞系中高表达,在低转移肿瘤细胞系中低表达,以及在相应的细胞实验中,发现 LASS2 对 HCCLM3 细胞泌氢的影响,提示着基因 LASS2 对肿瘤转移的影响可能是通过影响 V-ATPase质子泵而实现的。