研究背景胆管癌(cholangiocarcinoma,CCA)属于胆管系统的一类上皮恶性肿瘤,其发病率位居肝脏恶性肿瘤疾病第二位。由于其广泛转移、早期侵袭以及缺乏有效的治疗等特点,胆管癌通常被认为是侵袭性癌症。尽管胆管癌的发生率相对不高,但有证据表明近几十年来,其在泰国、东南亚和中国的发病率和死亡率呈逐渐上升的趋势。因此,探索更多、更有效的预防和治疗胆管癌的手段是目前医学研究人员亟待解决的问题。微小RNA(microRNA,miRNAs)是一系列不具有蛋白编码功能的小RNA分子,长度约为18-22bp,并具有在翻译后水平调控基因表达的功能。已有研究表明,miRNAs在人类癌症中的表达量异常,提示miRNAs可能在肿瘤的发生和发展过程中扮演重要角色。近年来,中医药治疗肿瘤疾病备受关注,该治疗方法的优势是以整体和宏观角度看待病人和疾病之间的关系,其应用的有效性和安全性是该治疗方法的特点。防己科植物千金藤是一种具有广泛应用价值的传统中药材,现代药理学和临床医学研究表明,千金藤可以作用于解热、镇痛、抗菌消炎、止血、散癖、消肿、利尿等方面。千金藤素(Cepharanthine)是从千金藤、地不容中分离提取的双苄基异喹啉生物碱,具有多种生物活性,其抗肿瘤作用得到了非常广泛的研究报道。体内体外试验研究表明,千金藤素可以通过抑制肿瘤细胞的生长、诱导肿瘤细胞再分化、诱发肿瘤细胞凋亡、逆转肿瘤多药耐药,提高化疗药物活性以及抑制肿瘤浸润和转移等多种机制多种途径起到抗肿瘤的作用。近期研究发现,中医药应用在肿瘤疾病治疗过程中,可能是通过调节miRNAs的表达量,从而发挥其显著的抑癌作用。因此,探究中医药治疗过程中涉及的功能miRNAs,有利于进一步分析药物抗癌作用机制,从而在分子水平上协助中医药物发挥更加有效的癌症治疗效果。目前还没有研究报道过千金藤素在抑制胆管癌进展过程中涉及的功能性miRNAs,因此,本研究在分析和验证千金藤素对胆管癌细胞抑制的作用基础上,筛选分析潜在功能miRNAs,利用miRNAs探索千金藤素抗癌作用的潜在分子机制,为千金藤素治疗胆管癌提供有力的科学依据。研究目的1.验证千金藤素对胆管癌细胞的抑制作用;2.筛选分析千金藤素对胆管癌细胞发挥抑制作用过程中的功能miRNAs,并对该miRNAs的生物学功能进行研究;3.探索千金藤素抑制胆管癌进展的相关分子机制;研究方法1.本研究选择胆管癌细胞系HCCC-9810作为研究对象,使用不同浓度千金藤素(2、5和10 μM)处理癌细胞,处理时间分别为24、48和72 h,使用CCK-8法分析千金藤素处理后癌细胞的增殖能力变化,利用Transwell法检测处理后癌细胞的迁移和侵袭能力,采用流式细胞术检测经Annexin V-FITC/PI双染的癌细胞的凋亡情况,分析比较千金藤素对胆管癌细胞生命活动的影响。2.使用千金藤素处理胆管癌细胞后,进行miRNA微阵列平台检测,对比未使用千金藤素处理的癌细胞,分析千金藤素处理的癌细胞中miRNAs的差异表达谱,研究发现有14个miRNAs表达量发生了显著变化,其中差异最为显著的是miR-29a;以HCCC-9810作为研究对象,使用不同浓度千金藤素(2、5和10 μM)处理胆管癌细胞24、48和72 h后,利用实时荧光定量PCR进一步验证和分析细胞中miR-29a的表达量变化情况。3.收集临床125例胆管癌患者和68名健康志愿者的血清样本,使用荧光定量PCR分析研究miR-29a在血清样本中的表达水平;通过卡方检验分析miR-29a表达量与患者临床病理特征之间的关系;以胆管癌细胞HCCC-9810作为研究对象,分别利用CCK-8、Transwell和流式细胞术检测调控miR-29表达水平后细胞的增殖、迁移和侵袭以及凋亡情况。4.体外调控miR-29a在胆管癌细胞中的表达水平,并使用千金藤素处理癌细胞,分别利用CCK-8、Transwell和流式细胞术检测细胞增殖、转移、侵袭和凋亡情况,从而分析miR-29a对千金藤素抗癌作用的影响;使用Western blot检测千金藤素处理后,细胞凋亡相关蛋白的表达量变化,并进一步使用罗丹明123染色,检测激发后细胞的线粒体膜电位变化情况。研究结果1.本研究的结果表明,千金藤素可显著抑制胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并具有促进胆管癌细胞凋亡的作用,证实了千金藤素对胆管癌细胞的抑制作用。2.miRNA微阵列检测分析结果表明,有14个miRNAs的表达量在千金藤素处理的细胞中发生了显著变化,其中差异最为显著的是miR-29a;通过实时荧光定量PCR的检测,证明千金藤素在胆管癌中可显著抑制miR-29a的表达量,且此抑制作用表现出时间和剂量依赖性。3.miR-29a在胆管癌患者血清中表达量显著上调,且与胆管癌患者的淋巴结转移、临床分期和分化程度显著相关;根据胆管癌患者和健康志愿者血清中的miR-29a表达量水平,我们建立了受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC),并证明了miR-29a在胆管癌中具有较高的诊断价值,其曲线下面积(area under the curve,AUC)是0.867,最佳截断值是1.710,对应的灵敏度是78.4%,特异性是85.3%,说明miR-29a可能是胆管癌潜在的有效诊断标记物。此外,体外调控miR-29a的表达水平,检测miR-29a表达对胆管癌细胞生命活动的影响,发现过表达miR-29a可促进胆管癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,并可显著抑制细胞的凋亡,而抑制miR-29a则降低了癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,并促进了癌细胞的凋亡。因此我们认为,miR-29a具有促进胆管癌进展的作用。4.为探究千金藤素在胆管癌中的抗癌作用机制,我们研究体外调控miR-29a对千金藤素抗癌作用的影响,结果表明过表达miR-29a可显著逆转千金藤素对胆管癌细胞增殖、迁移和侵袭以及凋亡的作用,证明miR-29a参与了千金藤素在胆管癌中的抗癌作用过程;此外,考虑千金藤素对胆管癌细胞凋亡作用的影响,本研究还发现了千金藤素处理胆管癌细胞中Bcl-2蛋白家族表达量发生显著变化,其中抑凋亡蛋白Bcl-2表达下调、促凋亡蛋白Bax表达上调,且千金藤素处理细胞后,胆管癌细胞的线粒体膜电位发生了明显的下降,说明千金藤素促进胆管癌细胞凋亡还可能是通过调控Bcl-2家族蛋白表达,从而改变线粒体膜通透性,进而使一系列凋亡因子从线粒体内释放到细胞质中,激活下游的Caspase家族,最终达到促进细胞凋亡的作用。结论1.千金藤素对胆管癌细胞具有明显的抑制作用,其可通过下述机制抑制肿瘤进展:(1)下调miR-29a表达水平,从而抑制肿瘤细胞的生命活动;(2)调节Bcl-2家族蛋白的表达,增强线粒体膜的通透性,进而诱导肿瘤细胞的凋亡。2.miR-29a参与了胆管癌的发展,并具有促进肿瘤细胞生命活动的功能。意义本研究在验证千金藤素对胆管癌细胞的抑制作用基础上,从miRNA层面探究了千金藤素抗癌作用的相关分子机制,阐明了miR-29a在胆管癌中表达的临床意义和生物学功能,发现千金藤素可通过下调miR-29a表达水平,从而发挥其在胆管癌中的抗癌作用。本研究的结果将为改善千金藤素在胆管癌治疗中的应用以及miRNAs协助中医药治疗癌症提供理论依据。