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维生素B12作为辅酶以腺钴胺和甲钴胺形式参与微生物多种重要代谢活动,因此维生素B12被视为一种重要的资源,在许多微生物之间流通、交换,实现对微生物生长与代谢活动的调控。已有研究发现,维生素B12类似物C-内酯对大肠杆菌有显著的抑制作用,但是目前,对于维生素B12类似物对食品微生物的生长调控及抑菌机理尚未系统研究,因此研究维生素B12及其类似物对常见食品微生物的抑制作用和机理对于新型抑菌剂的开发具有重要的科研与应用价值。本文以维生素B12及其类似物作为研究对象,探究其对食品微生物生长的影响及其机理。本实验室成功地用化学修饰的方法得到维生素B12类似物,在实验中发现C-10-溴甲钴胺(MeCbl-C-10-Br)对单增李斯特菌有明显的抑制作用。依次通过对维生素B12依赖型酶和核糖体开关的研究,对MeCbl-C-10-Br的抑菌机理进行探讨。主要内容和结果如下:1)通过氰/甲钴胺与卤化剂在不同反应条件下反应,得到结构类似的维生素B12类似物CN-γ-内酯钴胺素和MeCbl-C-10-Br,较佳反应条件如下:反应原料氰钴胺/甲钴胺与卤化剂摩尔比为1:1至1:1.2,反应温度为30 ℃,在弱酸条件下搅拌反应2.5 h。反应产物和四种维生素B12经SPE固相萃取小柱纯化后用HPLC检测,得到了优化的HPLC分析条件:色谱柱:C18 4.6*250 mm,流动相:0.1%甲酸水溶液-乙腈(A-B),柱温:25 ℃,流速:l.0mL/min,进样体积:20μL,检测波长:361nm,洗脱梯度:0-5min,90%A,5-25min,70%A,25-30min,30%A,3-40min,90%A。反应产物和维生素B12通过LC-MS进行了结构验证。2)采用96孔板法测生长曲线,比较CN-γ-内酯钴胺素、MeCbl-C-10-Br、氰钴胺、甲钻胺分别对大肠杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、肠道沙门氏菌、婴儿双歧杆菌和罗伊氏乳杆菌的生长调节作用。实验结果显示MeCbl-C-10-Br对革兰氏阳性菌单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和罗伊氏乳杆菌的生长有抑制作用,对大肠杆菌的生长有促进作用,对肠道沙门氏菌和婴儿双歧杆菌没有显著的调控作用。CN-γ-内酯钴胺素对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和罗伊氏乳杆菌的生长略有抑制,对大肠杆菌、肠道沙门氏菌和婴儿双歧杆菌没有明显作用。相比于CN-γ-内酯钴胺素,MeCbl-C-10-Br的抑制作用更明显,尤其是对有害菌单增李斯特菌。通过改变培养基pH值发现CN-γ-内酯钴胺素和MeCbl-C-10-Br对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、罗伊氏乳杆菌的抑制作用在中性环境最佳,否则细菌不能正常生长或者表现不出差异性。改变MeCbl-C-10-Br浓度检测对有害菌金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的最小抑菌浓度,结果显示MIC分别是1 ng/mL和0.125 ng/mL,意味着维生素B12类似物MeCbl-C-10-Br对单增李斯特菌的抑制作用更强。3)通过应用腺钴胺依赖型酶甘油脱水酶和甲钴胺依赖型酶甲硫氨酸合成酶的粗酶液体系,探究维生素B12及其类似物对维生素B12依赖型酶的酶活影响。结果显示,在甘油反应体系中,维生素B12及其类似物的催化活性从大到小为MeCbl-C-10-Br>CN-γ-内酯钴胺素>甲钴胺>氰钴胺>腺钴胺,说明维生素B12及其类似物均催化甘油发生脱水反应生成丙烯醛。在甲硫氨酸反应体系中,反应产物均有甲硫氨酸产生,说明在体外粗酶液中,维生素B12及其类似物均可催化反应,且MeCbl-C-10-Br的催化活性最强。结果表明与甲钴胺相比,MeCbl-C-10-Br对甘油脱水酶和甲硫氨酸合成酶具有较高的催化活性,与MeCbl-C-10-Br抑制单增李斯特菌生长相悖,意味着MeCbl-C-10-Br的抑菌作用不是通过调控维生素B12依赖型酶的酶活。4)通过生物信息学方法寻找转运蛋白、合成蛋白、功能蛋白相关的维生素B12核糖体开关的目的基因,构建维生素B12核糖体开关-p519ngfp重组载体质粒。合成的目的基因构建在pUC57载体质粒上,质粒经PCR后得到带有酶切位点的维生素B12核糖体开关基因序列,通过双酶切得到大量具有黏性末端的目的基因片段。p519ngfp载体质粒用试剂盒从扩培的大肠杆菌DH5 α中提取,经双酶切得到线性质粒。具有相同黏性末端的目的基因片段和线性载体质粒重组,得到重组载体质粒。5)核糖体开关是位于mRNA 5’端的非表达片段,伴随着其结构的改变具有调节蛋白表达的能力。本研究评价了不同浓度的氰钴胺、甲钻胺、CN-γ-内酯钴胺素和MeCbl-C-10-Br分别对单增李斯特菌维生素B12核糖体开关调控作用。对于维生素B12转运蛋白相关的核糖体开关,CN-γ-内酯钻胺素有促进作用,氰钴胺、甲钴胺和MeCbl-C-10-Br则表现为抑制,且高浓度的MeCbl-C-10-Br对转运型核糖体开关的抑制作用比氰钻胺、甲钻胺强。对维生素B12合成蛋白相关的核糖体开关,氰钴胺和MeCbl-C-10-Br有抑制作用,甲钴胺有促进作用,CN-γ-内酯钻胺素没有明显调控作用。对维生素B12功能蛋白相关的核糖体开关,甲钻胺和MeCbl-C-10-Br表现出明显的抑制作用,且后者的抑制作用更强。氰钴胺表现出较为明显的促进作用,而CN-γ-内酯钴胺素的促进作用不显著。结果表示MeCbl-C-10-Br对维生素B12转运蛋白、合成蛋白和功能蛋白相关的核糖体开关均有明显的抑制作用,甲钻胺对合成相关的维生素B12核糖体开关有促进作用,对转运和功能相关的核糖体开关则表现出抑制作用,强度弱于MeCbl-C-10-Br,说明维生素B12类似物MeCbl-C-10-Br对单增李斯特菌的抑菌位点在维生素B12核糖体开关。由此可见,维生素B12类似物MeCbl-C-10-Br对单增李斯特菌有明显的抑制作用,其抑菌机理不是通过调节维生素B12依赖型酶甘油脱水酶和甲硫氨酸合成酶的酶活,而是通过抑制维生素B12核糖体开关,从而抑制相关蛋白的表达,进一步影响单增李斯特菌的正常生长。