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本试验以从屠宰场采集废弃的猪卵巢为研究材料,对卵母细胞体外成熟培养体系以及孤雌囊胚胚胎干细胞的分离培养进行了探究。首先以亮甲酚蓝染色对成熟培养前的卵母细胞进行筛选,并通过添加db-cAMP来达到核质的同步成熟,进而提高卵母细胞的体外成熟质量;随后以孤雌激活后得到的囊胚为材料,从胚龄、饲养层以及内细胞团的分离几个方面对孤雌胚胎干细胞的分离培养进行了探究。试验主要结果如下:1.以13、26、39、52μmol/L的亮甲酚蓝(brilliant cresyl blue,BCB)对成熟培养前的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)染色90 min,比较不同浓度的BCB对卵母细胞的着色率、成熟率以及孤雌激活胚胎和核移植胚胎的早期发育情况。分析结果显示,BCB浓度为26μmol/L时,经染色的COCs既有较高的着色率,而又不影响其体外成熟的效率。挑选BCB+组卵母细胞进行孤雌激活和核移植试验,其卵裂率和囊胚率均显著高于BCB-组(P<0.05)。胚胎移植试验挑选BCB+组中发育较好的1~2细胞期重组胚对5头代孕母猪进行了移植,其中2头怀孕,1头顺利产下了6头健康胎儿。2.成熟培养液中分别添加0、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol/L的db-cAMP时,卵母细胞的成熟率随着浓度的增加依次降低,但浓度为1 mmol/L时,孤雌激活后的囊胚率最高(27.03%);卵丘细胞单层与卵母细胞共培养时,其成熟率、卵裂率及囊胚率(86.00%、89.04%、28.36%)也得到了显著提高;0.4 mmol/L的db-cAMP和卵丘细胞单层共培养时,其成熟率和卵裂率(85.78%和88.95%)与对照组差异不显著,但囊胚率(35.14%)显著提高。3.试验研究了囊胚的胚龄、饲养层的种类及囊胚的不同处理对猪孤雌囊胚胚胎干细胞分离培养的影响。实验结果显示:①第8天的囊胚贴壁率(25.00%)显著高于第7天和第9天;②以小鼠胎儿成纤维细胞为饲养层时贴壁率为18.52%,显著高于猪胎儿成纤维细胞和猪子宫上皮细胞饲养层(P<0.05);③取孤雌激活后第8天的囊胚分成全胚组、孵化囊胚组、去透明带组和分离内细胞团(ICM)组进行体外培养时,分离的ICM贴壁率明显高于其他组(P<0.05)。