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牙周膜干细胞(PDLSCs)具有克隆、自我复制和多向分化的能力,因其经过诱导后可分化为成骨细胞、成纤维样细胞和脂肪细胞等,在牙组织工程中有极高的应用潜力。然而h PDLSCs的分化机制仍不十分清楚,这极大的限制了其组织工程走向临床应用。已有研究表明,Wnt/β-catenin信号途径参与干细胞的成骨分化,促进干细胞向成骨细胞方向分化并抑制成骨细胞发生矿化[1][38],,Wnt/β-catenin途径中关键蛋白因子β-catenin的积累和稳定表达提示该通路被激活,β-catenin与细胞增殖和分化能力密切相关[19]。本课题研究小组前期证实动态张应力促进hPDLSCs成骨分化,然而Wnt/β-catenin是否参与了hPDLSCs应力下成骨仍有待进一步研究。本研究首先探明h PDLSCs在应力成骨时Wnt/β-catenin通路被激活;再使用小分子激动剂和抑制剂干预Wnt/β-catenin通路活化水平,观察对h PDLSCs应力成骨分化的影响,借以探讨Wnt/β-catenin信号通路对h PDLSCs应力成骨的调控作用,以期从分子水平探讨矫治性牙位移动的发生机制并为hPDLSCs组织工程提供理论基础。目的:探究Wnt/β-catenin信号通路对h PDLSCs应力成骨的调控作用,探索h PDLSCs的应力成骨分化的分子机制。方法1.分离获得hPDLSCs的原代细胞,筛选以β-catenin为靶点的适宜浓度的激动剂WAY262611和抑制剂XAV939作用于第3-6代h PDLSCs,并计算药物的半最大效应浓度(EC50),在该浓度下培养1-4天后用CCK-8法检测hPDLSCs增殖活力。另外通过免疫印迹法(Western blot)检测激动剂和抑制剂作用下h PDLSCs的β-catenin蛋白表达。2.利用FX-4000T加载系统促进hPDLSCs应力成骨,并测定成骨标志物BMP2、Runx2、ALP的表达,同时利用Western blot对h PDLSCs在应力成骨时β-catenin蛋白的表达变化进行测定。3.将所获得的hPDLSCs分激动剂组、抑制剂组、DMSO组(对照组)、正常组进行张应力加载,并用Western blot测定对比各组成骨标志蛋白BMP2、Runx2、ALP的表达情况。结果1.成功分离获得了hPDLSCs的原代细胞,其Vimentin阳性表达,pan-cytokeratin阴性,CD146和STRO-1阳性,且所获得细胞系具有诱导成骨/成脂能力,鉴定确认其为hPDLSCs。2.激动剂WAY262611和抑制剂XAV939的EC50浓度分别为2.310umol/L和22.99umol/L,EC50浓度下的激动剂WAY-262611/抑制剂XAV939能使hPDLSCs的β-catenin表达增加/下降,调控hPDLSCs的β-catenin基因表达。CCK-8检测发现,所选激动剂和抑制剂均使hPDLSCs的增殖活力较对照组有所下降。3.hPDLSCs在外源性张应力作用下,成骨相关标志物ALP,Runx 2,表达水平增加。h PDLSCs成骨分化过程中β-catenin表达水平增加(P<0.05),提示β-catenin参与hPDLSCs应力成骨过程。4.激动剂组与DMSO对照组相比,成骨标志物ALP在动态张应力加载后0-12h期间表达随时间递增,差异有统计学意义;在抑制剂组中,β-catenin及成骨标志物表达未发现明显趋势。结论1.所选浓度激动剂WAY262611和抑制剂XAV939作用hPDLSCs使其增殖活力下降。2.β-catenin蛋白参与并促进了PDLSC在应力条件下早期的成骨活力。hPDLSCs应力成骨调控机制研究的深入,为牙齿矫正过程中的安全移动提供保障;从增强成骨分化的角度,还有望缩短口腔临床正畸过程的复诊时间,提高矫正效率,优化治疗流程。