近年来,口腔种植技术发展迅猛,种植修复已经成为最理想的缺牙和颌骨缺损修复方式。然而,许多患有全身系统性疾病(如糖尿病、心血管疾病、骨代谢性疾病、出血性疾病、自身免疫性疾病等)的缺牙患者种植失败率较高,效果不理想,极大地制约了种植修复的进一步推广。特别是糖尿病缺牙患者的种植失败率较高,然而随着我国经济的发展和生活方式的转变,糖尿病的发病率在逐年递增,患者数量已居世界第二位。因此,如何提高糖尿病患者的种植牙成功率已成为国内外学者研究的重点和难点。本课题正是基于这一现状,通过研究与人2型糖尿病相似的大鼠模型,从局部持续释放多肽性生长因子刺激新骨形成提高骨结合率的角度,拟作前瞻性的探索研究,为临床提高2型糖尿病患者种植牙成功率提供新思路和理论依据。研究目的:以GK大鼠为基础,建立与人类2型糖尿病相似的种植研究动物模型,并在此模型上观察、分析、证实2型糖尿病对种植体周围骨结合的初期破坏作用和影响。采用W/O/W双层乳液法,通过可降解生物聚合物PLGA包裹多肽性生长因子rrIGF-1制备微球在种植体周围构建理想的具有持续释放能力的缓释系统,并作SEM、CLSM观察、分析微球的大小、形态学特征等,在体外作释放动力学研究并证实微球的持续释放能力,同时作微球的rrIGF-1生物活性检测并证实微球的效力。在数量相同两组的2型糖尿病大鼠种植体周围分别加载包裹rrIGF-1和安慰剂的PLGA微球作对比研究,利用rrIGF-1的持续释放刺激种植体周围成骨细胞的潜在分化和新骨形成,从而改善种植体的骨结合率,为下一步PLGA包裹rhIGF-1构建缓释体系作用于2型糖尿病患者牙槽骨细胞的体外临床应用研究奠定实验基础,并且为下一步解决2型糖尿病患者种植高失败率这一棘手问题提供新思路。实验方法和结果:实验一:方法:将9周龄大10只SPF级GK大鼠和10只相同周龄的正常Wistar大鼠分为两组置于同一环境下,GK大鼠组采用高脂高糖特制饲料喂养4周后,尾静脉穿刺检测血糖均大于300 mg/dL(16.7 mmol/L),获得10只13周龄的2型糖尿病大鼠模型和10只13周龄的正常Wistar大鼠,组成了2型糖尿病大鼠组和空白对照大鼠组。然后在两组大鼠左侧胫骨骺端分别植入3.3×6mm的纯钛种植体(表面已经过MAO处理),分别于术后4周、8周处死两组中5只大鼠,取下胫骨制样、包埋,制备30μm厚的不脱钙硬组织切片,丽春红染色后分析测量BIC和TBV,比较两组之间的差异。结果:(1)整个实验过程中(术时、术后4周、术后6周、术后8周),2型糖尿病大鼠组和空白对照大鼠组血糖值均有统计学差异(P<0.05)。(2)术后4周和术后8周,2型糖尿病大鼠组和空白对照大鼠组的BIC和TBV均有统计学差异(P<0.05)(除去术后4周两组之间的TBV,P>0.05)。(3)组织形态学分析可见:空白对照组大鼠种植体周围为薄层骨板,骨组织连续性较好,大部分有骨组织接触;而2型糖尿病大鼠组种植体周为骨组织和大量纤维结缔组织的混合,骨组织连续性较差,种植体周围有明显的区域无骨组织接触。实验二:方法:利用以色列Prospec公司提纯的rrIGF-1作内层亲水向W1相、PLGA和Span80作O相,PVA和tween80作W2相,采用W/O/W双层乳液法制备微球,对所获微球作SEM、CLSM分析,观察微球的表面和空间形态、大小及包裹完整与否,测量包裹率;同时取定量的PLGA微球分析,释放的rrIGF-1用Lowery-Peterson蛋白定量法检测,通过累积释放率随释放时间的变化绘制释放动力学曲线;释放出的rrIGF-1的生物学活性用一个MTT生物鉴定法检测,静止期的MG-63对增加的rrIGF-1显示了一个剂量依赖的促有丝分裂反应。最后对所得图像、数据逐一分析,得出微球的基本特征和作为药物持续释放体系的特征。结果:(1)微球的表面形态和立体空间构象如后面正文中SEM图片所示,大小均匀,表面较光滑,光散射测定微球的体积,微球粒径为1.2525±0.6436μm。(2)激光共聚焦显微镜下可见微球包裹完整,外层GENMED尼罗红(CLSM下显示红色)完全包覆内层亲水的W1相,同时微球周围可见部分黑点,表明微球正在缓慢释放。实验所得微球的包裹率为78.3±2%,与先前用此法包裹亲水性多肽的研究结果大致相同。(3)实验所获微球具备良好的持续释放能力,2天和5天后的释放率分别为55.3%和64.8%,大约85%的rrIGF-1在第20天时从PLGA微球中释放,此后释放较为缓慢,剩余的15%的rrIGF-1在第20天到第40天被释放完全;适用于干预治疗糖尿病大鼠种植体的初期骨结合。实验三:方法:利用实验第一部分的方法建立20只2型糖尿病大鼠模型,随机分为两组(rrIGF-1微球治疗组和对照组)。在rrIGF-1微球治疗组的糖尿病大鼠种植体植入前用200μg负载rrIGF-1的PLGA微球(实验第二部分所获得的)混合血凝块植于种植窝,加载在种植体周围,对照组用200μg包裹安慰剂的PLGA微球作上述处理。分别于术后4周、8周处死两组中5只大鼠,取下胫骨制样、包埋,制备30μm厚的不脱钙硬组织切片,丽春红染色后分析测量BIC和TBV,比较两组之间的差异;同时对两组大鼠的骨—种植体界面分别作SEM分析,对比两组之间的差异。结果:(1)术后4周,rrIGF-1微球治疗组糖尿病大鼠和对照组糖尿病大鼠的BIC有统计学差异(P<0.05),但TBV无统计学差异(P>0.05);术后8周,rrIGF-1微球治疗组糖尿病大鼠和对照组糖尿病大鼠的BIC和TBV均有统计学差异(P<0.05)。(2)组织形态学分析可见: rrIGF-1微球处理组种植体周围骨组织密度和成熟度均较对照组高,沿种植体内面可见新骨形成更明显;而对照组种植体周围骨组织反应不一致更明显。(3) SEM高倍观察下可见rrIGF-1微球处理组成骨样细胞与Ti种植体界面贴附较对照组更紧密,间隙较小,骨结合更完善。研究结论:(1) 2型糖尿病对大鼠种植体周围早期骨结合的发生有明显的破坏和干扰作用,存在大量纤维骨性愈合,骨组织连续性差,导致骨结合率较低。(2)采用W/O/W双层乳液法、以可降解生物聚合物PLGA为基料,可以在体外构建理想的rrIGF-1持续释放系统并作用于种植体周围,其大小、粒径、包裹率、持续释放能力、释放因子活性均较为理想,可用于刺激成骨细胞潜在分化和新骨形成。(3)持续释放rrIGF-1对2型糖尿病大鼠种植体周围的初期骨结合有明显的促进作用,同时本研究证实了局部从PLGA微球中持续释放rrIGF-1可以刺激种植体周围的新骨形成。(4)在本研究的基础上,可在体外进一步实验,证实持续从PLGA微球中释放rhIGF-1到2型DM患者牙槽骨细胞周围有无促进作用,为临床上下一步解决2型糖尿病患者种植牙高失败率这一棘手问题另辟蹊径。