背景:微孢子虫(Microsporidia)属于严格细胞内寄生的真核微生物。迄今为止,微孢子虫共计有超过200属,已报道的微孢子虫共有1500余种,尚未发现和报道种类还有很多,每年都有许多新种和相关宿主的报道。它在自然界宿主域广泛,可以侵袭脊椎动物和无脊椎动物等绝大多数生物,呈世界范围性分布。微孢子虫不仅是重要的人畜共患病病原,还能够入侵虾、蟹类等重要经济甲壳动物,可以导致寄主活性降低,组织器官病变,重度感染时可致使宿主死亡。建立快速、特异和灵敏检测微孢子虫技术方法能够有效的降低生产实践中的经济损失。因此,开展对微孢子虫分离鉴定和检测方法建立的研究,为微孢子虫基础研究和检测鉴定提供科学依据。目的:分离和鉴定中华小长臂虾(Palaemonetes sinensis)病原,观察病原的形态结构以及在肝细胞内各个时期生活史的形态特征,确定中华小长臂虾微孢子虫(Enterocytospora artemiae)与其它微孢子虫的亲缘关系。建立中华小长臂虾微孢子虫的荧光定量PCR检测方法,为E.artemiae的研究提供基础数据支持和构建检测方法。方法:体视显微镜观察中华小长臂虾组织的患病症状,取强阳性虾肝胰腺组织和Percoll梯度离心纯化的孢子在显微镜和电镜下观察。先用微孢子虫通用型引物进行常规PCR扩增,再将检测呈阳性的扩增产物送至生物公司进行基因双向测序,最后测序结果在NCBI的BLAST进行序列比对。最大似然法分析比较其它微孢子虫18S r DNA序列数据和具有高度序列相似性的物种,以构建系统发育树。纯化虫体的DNA经二代高通量测序获得E.artemiae部分基因序列,用Primer 5.0软件设计并筛选针对E.artemiae的特异性引物,构建SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测E.artemiae技术。结果:感染微孢子虫的中华小长臂虾肝胰脏颜色发白,黑点颜色深,数量多且集中,严重者肌肉白化,透明度降低。成熟的中华小长臂虾微孢子虫为单核的短杆状或椭圆形,新鲜孢子大小约3.1×2.4μm,负染固定孢子大小为1.1×1.9μm,直径约为103 nm。孢子壁由15 nm孢子外壁和83 nm孢子内壁组成,极管数目为5-6圈。经过BLAST序列比对分析为Enterocytospora artemiae。E.artemiae属于微孢子虫的进化枝IV,分组在Enterocytospora-like进化枝的分支内。微孢子虫在同一纳虫空泡中存在不同时期的孢子,E.artemiae裂殖增殖方式为二分裂,孢子增殖为原质团分割。肝腔中存在游离的含孢子的纳虫空泡。荧光定量PCR检出限为9.4×10~1copies/μL,相比较常规PCR灵敏度高10倍以上,并且呈现良好的特异性和稳定性。结论:在盘锦市养殖的中华小长臂虾感染了微孢子虫,根据该寄生虫的生活史特征,形态结构和SSU r DNA序列分析,鉴定该微孢子虫为Enterocytospora artemiae,以前仅在欧洲和北美的卤虫(Artemia)中进行过描述。这是在亚洲和重要水产养殖产品中首次发现的E.artemiae,本次研究也是第一个建立了E.artemiae的荧光定量PCR检测方法。