论文部分内容阅读
目的（1）研究碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯（CRKP）致病菌的耐药特性、分子分型、播散特点及临床分布,明确CRKP致病菌的分子生物学特征及其临床意义。（2）旨在观察卡托普利体内外逆转产金属酶CRKP菌的耐药现象,增敏抗菌药物的作用。（3）深入探索卡托普利对IMP-4金属酶的抑制动力学,以表征卡托普利对IMP-4金属酶的亲和能力,为探究产金属酶菌的耐药治疗开辟新的途径。材料与方法菌株来源:收集我院20132016年连续分离的CRKP菌327株（已剔除重复株及资料缺失株）,本实验共纳入98株CRKP病原菌。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 700603、ATCC 1705及ATCC 1706。方法:1.（1）采用Vitek 2全自动微生物鉴定仪重新鉴定及药敏测试,通过K-B纸片扩散法检测菌株对碳青霉烯药物的敏感性,琼脂稀释法检测菌株对抗菌药物的最小抑菌浓度（MIC）;分别运用改良Hodge试验和碳青霉烯酶失活法（mCIM与eCIM联合）测定碳青霉烯酶的表型;PCR扩增及测序检测其主要的耐药基因;采用多位点序列型（MLST）和脉冲场凝胶电泳（PFGE）对菌株进行分子分型及同源性分析;结合菌株的临床分布特点,分析其传播方式。（2）调查87例菌株对应的临床资料,以30天死亡及ST11 CRKP作为观察点,建立logistic回归模型,分析优势株ST11CRKP对预后的影响;通过CRKP分子生物学的调查,分析63例特定群体（院内获得性肺炎）相关CRKP致病菌的耐药特性、分子分型及临床分布特点。72.卡托普利作用于产金属酶耐药菌的体内外实验:筛选5株临床分离的产金属酶CRKP菌,进行卡托普利与美罗培南体外联合实验,分析卡托普利是否可抑制菌株对抗菌药物的耐药性。以产金属酶NDM-1 KP0106菌和产金属酶IMP-4 KP27630菌作为研究对象（两株菌对美罗培南的MIC相同）,分别建立大蜡螟幼虫的感染模型,经卡托普利联合美罗培南或单药给药方式,分析大蜡螟幼虫的生存曲线及体内菌负荷量的差异性变化,评估体内卡托普利是否能有效恢复耐药菌对抗菌药物的敏感性。3.通过构建表达载体pET28b-IMP4-BL21（DE）,经IPTG诱导表达、亲和层析柱纯化、SDS-PAGE及Western Blot鉴定,以便获得IMP-4蛋白。采用酶反应动力学实验,抑制剂浓度与酶残余活性的变化测定半抑制浓度IC50。改变卡托普利和底物的浓度,保持酶的浓度不变,测定数据,根据Lineweaver-Burk作双倒数图,判断酶抑制动力学参数,求解出抑制常数Ki,表征卡托普利对IMP-4金属酶的亲和能力。结果1.（1）药敏结果显示:98株CRKP菌对碳青霉烯类抗菌药物全部耐药（2株对亚胺培南中度耐药）,MICs范围为2μg/mL至64μg/mL,余11种常用抗菌药物,除对替加环素全部敏感外（2株中介）,对其他大多数抗菌药物均表现高度耐药;运用表型测定,表明74株产碳青霉烯酶,其中10株为金属酶阳性;PCR检测出6株携带blaNDM-1,4株携带blaIMP,其余60株均携带blaKPC-2,且KPC-2酶在3组年段中的检出率呈逐年增高趋势（p<0.001）;98株CRKP致病菌株中,共发现24种ST分型,序列型ST11为优势株（56.12%,55/98）,且在3组年段中的检出率与blaKPC-2保持一致性,也呈逐年增高趋势,具有显著差异性;95株CRKP菌（3株因染色体核酸降解被剔除）分为59个不同的型别（PFGE型,PT01-PT59）,46个型别只包含1株菌,即46株菌各具有独特的PFGE带型,说明菌群基因的多态性。MLST分型显示,3个主要优势带型的克隆株有29株为ST11型（93.55%,29/31）。而55株ST11型又共分为23种不同克隆带型,提示有多个ST型菌株的院外输入。同时,多组ST11型菌株具有相同克隆带型,提示存在着院内传播扩散。（2）通过对CRKP致病菌分子生物学的调查,不仅发现临床上合理的经验用药和总住院时间与CRKP感染预后（30天死亡）有独立的相关性,而且分析出ST11型菌株可作为CRKP感染预后的独立危险因素。院内获得性肺炎所相关的63株CRKP致病菌,有53株携带KPC-2酶,分为6种ST型,其中ST11有47株（88.68%）,ST23占2株（3.77%）,余ST15、ST528及ST661各占1株,提示存在较少的异质性克隆背景。优势克隆株ST11在各病房分布比例分别为ICU 72%,内科病房80.8%及急诊科室100%,说明院内获得性肺炎CRKP菌在院内克隆传播的普遍性及严重性。2.5株产金属酶的CRKP菌,在卡托普利的作用下,均使碳青霉烯类药物的MIC值明显下降,可降至1μg/mL（相当于原来MIC值的1/161/32倍）,且卡托普利对金属酶（NDM-1和IMP-4）的体外抑制作用呈剂量依赖性。建立大蜡螟幼虫感染模型,分别产NDM-1和IMP-4的两株CRKP菌对大蜡螟幼虫的致死率呈浓度依赖性;IMP-4组感染大蜡螟幼虫后,卡托普利联合美罗培南组与其它单药各组比较,生存率显著提高（p<0.0001或p=0.0121）,而NDM-1组未见生存率改变;单次给药的24h内,卡托普利联合组体内菌负荷量显著低于单药组,且IMP-4组较NDM-1组更为突出,说明卡托普利对于金属酶IMP-4抑制作用要高于NDM-1;单次给药的48h后,2株菌感染大蜡螟的组间菌负荷量均未见差异性,说明药物的抑菌作用具有时效性。3.表达载体pET28b-IMP4-BL21（DE）构建成功,以16℃8h作为pET28b-IMP4-BL21（DE）最佳诱导时间,表达纯化经鉴定后证实为IMP-4蛋白。卡托普利抑制剂浓度的不断增加,IMP-4残余活性不断下降,呈曲线相关性,经LOGIT拟合度检验,推算出IC50为26.34μM,95%置信度为19.8237.98μM。米曼氏方程中双倒数求解推导出,在竞争性抑制剂作用下,不管抑制剂浓度[I]如何变化,理论上其纵截距1/Vmax不变。根据不同[I]中横截距的变化,计算出Ki值为37.14μM。结论（1）CRKP致病菌的耐药机制以产KPC-2型碳青霉烯酶为主,呈逐年上升趋势。其菌株的基因分型具有遗传多态性,但ST11仍是其流行优势株,且以显著上升趋势的克隆传播为特征。临床分离ST11型CRKP致病菌不仅可作为感染后死亡事件的独立危险因素,并且其揭示了非异质性克隆传播是院内获得性肺炎播散的关键所在。（2）卡托普利在体内外可有效逆转产金属酶CRKP菌的耐药情况,恢复了菌株对抗菌药物的敏感性,为产金属酶耐药菌的研究展开新的方向。（3）酶抑制动力学定量和准确地评估了卡托普利对IMP-4金属酶的亲和能力,表观卡托普利对IMP-4金属酶活性有良好的抑制作用,为临床治疗奠定基础。