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目的:研究肝细胞癌变过程中缝隙连接蛋白32(Connexin32,Cx32)表达的变化,并进一步研究其与肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)侵袭迁移的关系及可能的机制,以期寻找新的抗肝癌转移分子生物学靶点,为临床上肝癌治疗提供新的方法和思路。方法:采用免疫组化法检测20例正常肝组织及76例HCC组织中Cx32的表达及定位,并对该蛋白与HCC临床病理特征之间的关系进行分析。进一步在体外选择人正常肝细胞LO2,及HCC细胞SMMC-7721、Hep G2和Huh7为工具细胞,采用Western blot法检测Cx32的表达,采用免疫荧光法观察Cx32的定位,采用Transwell和划痕实验检测细胞的侵袭和迁移能力。在明确Cx32表达变化和细胞侵袭迁移能力关系的基础上,使用分子生物学方法调控Cx32蛋白表达,观察细胞侵袭迁移能力的变化,并在此过程中观察EMT相关的细胞形态学和分子标志物变化。最后在组织学层面证实Cx32与EMT标志物之间的关系。结果:1.Cx32在HCC组织和细胞中的表达及临床意义研究结果发现与正常肝脏组织相比,Cx32在HCC组织中表达下调,且阳性表达的蛋白从细胞膜向细胞质的异位表达明显。临床病理特征关系分析表明Cx32蛋白表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期、肝病背景、脉管癌栓均无关(均P>0.05),而与组织学分级及淋巴结转移呈负相关(均P<0.05)。此外,较人正常肝细胞LO2,三种HCC细胞系中Cx32蛋白表达明显降低,其中SMMC-7721细胞相对高表达Cx32,而Hep G2细胞Cx32表达最为缺乏;免疫荧光实验进一步证实Cx32表达于LO2细胞膜及细胞质中,而在SMMC-7721细胞上Cx32主要定位于细胞质,可见组织学及细胞学结果一致证实Cx32在肝细胞癌变时伴随有表达下调及异位表达。2.Cx32负向调控HCC细胞的体外迁移和侵袭能力细胞学实验结果表明LO2细胞无明显侵袭特性;在几种HCC细胞系中,SMMC-7721较Hep G2和Huh7细胞Cx32蛋白表达高,但侵袭潜能显著低于其他两种HCC细胞。我们使用si RNA技术在SMMC-7721细胞上下调Cx32,相反,向Hep G2细胞转染Cx32 c DNA以过表达Cx32。细胞模型成功建立后,Transwell实验结果提示干扰SMMC-7721上Cx32表达后,细胞的侵袭能力显著增强;相反,在Hep G2细胞上成功上调Cx32表达后,该细胞的侵袭能力显著下降;同样的实验结果在细胞划痕实验中也得到证实。可见Cx32负向调控HCC细胞的迁移侵袭。3.Cx32影响HCC细胞EMT及其反向MET进程细胞形态学观察发现,在SMMC-7721细胞上,与阴性对照组相比,Cx32si RNA组的细胞明显拉长,呈长梭形,有丝状或片状伪足,且细胞间连接疏松。相反,在Hep G2细胞上,p EX-2/Cx32组细胞形态变圆,无明显丝状或片状伪足,且细胞间排列更紧密。Western blot检测发现,较空白对照组和阴性对照组的SMMC-7721细胞,Cx32 si RNA组细胞的上皮标志物E-cadherin蛋白表达明显减少、间质标志物Vimentin蛋白表达明显增多。同时,过表达Cx32的Hep G2细胞EMT标志蛋白发生相反的改变。免疫荧光结果进一步证实了调控Cx32带来的E-cadherin、Vimentin蛋白表达的改变,这些结果表明Cx32影响HCC细胞侵袭迁移可能与调控EMT有关。4.Cx32负向调控Snail并与HCC组织中EMT标志物表达相关Western blot结果发现无论在SMMC-7721或是Hep G2细胞上,调控Cx32均不能影响Slug和Twist-1的表达。然而,抑制SMMC-7721细胞上Cx32的表达上调Snail,而过表达Hep G2细胞上Cx32表达带来Snail的显著下调。免疫荧光结果也提示在该两种HCC细胞系上Cx32负向调控Snail蛋白表达。此外,研究也发现在高表达Cx32的正常肝细胞LO2中Snail表达基本缺失,而低表达Cx32的HCC细胞系SMMC-7721及Hep G2中Snail高表达。进一步通过对76例HCC临床样本中的34例进行了包括Snail在内的EMT标志物的研究,发现18例出现E-cadherin的表达下降或缺失;Snail主要定位于肿瘤细胞质和细胞核,21例呈阳性表达;β-catenin主要定位于细胞膜,其中出现细胞质和细胞核阳性表达的高达41.18%(14/34)。几个指标的进一步相关性分析证实Cx32表达与E-cadherin表达呈正相关(r=0.528,P=0.001),与Snail核内表达呈负相关(r=-0.448,P=0.008),与β-catenin核内蓄积呈负相关(r=-0.457,P=0.007)。5.Cx32对Snail的负向调控与其生物学效应的发挥至关重要为了明确Snail介导的EMT是否与Cx32的生物学效应密切相关,我们紧接着在Snail干预下观察Cx32的作用。结果发现在SMMC-7721细胞,抑制Snail的表达能拮抗下调Cx32所致的EMT标志蛋白和细胞形态学的改变,并最终恢复细胞的侵袭能力;同样地,在Hep G2细胞上,上调Snail也能逆转过表达Cx32带来的生物学效应。以上结果表明Cx32通过影响Snail表达调控HCC细胞EMT相关的侵袭。结论:Cx32在肝细胞癌发生时伴随有表达下调及异位表达,并且下调的Cx32通过诱导Snail相关的EMT而促进HCC细胞的侵袭转移。