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自1950年美国科学家发现在饲料中添加金霉素可以促进食用动物生长后,在饲料中添加促生长类抗生素在动物养殖业迅速普及。通过添加促生长类抗生素,达到了提高动物生长速度,提升饲料利用效率,同时降低动物死亡率的目的。但饲料中大量抗生素的使用使病原体耐药性不断提升,人类和动物健康受到了严重威胁,人类社会为此也付出了代价,近年来包括中国在内的众多国家开始在饲料中禁止添加促生长类抗生素,在此背景下开发促生长类抗生素替代品成为研究热点。研究认为促生长类抗生素能够发挥促动物生长作用,除其具有抑菌作用外,还因其可抑制ROS、促炎症细胞因子等引起的炎症反应,从而发挥促生长作用。在现代畜牧养殖业使用的饲料由于原料污染等原因往往含有一定浓度的霉菌毒素,喂食此类饲料后经常引起氧化损伤,产生大量ROS,导致动物发生炎症反应,从而延缓动物生长,严重者导致其疾病。超氧化物歧化酶(SOD)是一类可催化超氧化物阴离子自由基发生歧化反应的金属类酶,作为一种细胞抗氧化剂,可以降低动物细胞中过量ROS引起的氧化应激反应,缓解霉菌毒素等对动物造成的损伤及炎症,促进动物生长,是一种有效的抗氧化酶制剂类替抗候选产品。当前商业化SOD产品大都从动植物中提取获得,但动植物中含量低,提取收率低,稳定性差等问题一直是SOD规模化生产的制约因素。为开发可用于饲料添加剂且可以工业化、规模化生产的低成本SOD产品,本研究主要完成了以下几方面的工作:(1)使用 Escherichia coli BL21(DE3)异源表达了 来源于嗜热菌 Alicyclobacillus sp.HJ的超氧化物歧化酶(AaSOD),提取纯化后对AaSOD纯化蛋白酶学性质进行表征。确定AaSOD具有嗜酸耐热的性质,在pH 4.0的环境下保存其活性保持最高,在70℃下处理1 h,酶活性保持90%以上,在80℃下处理1 h后酶活仍保持了 50%。利用差示扫描量热法测定AaSOD的Tm值为89.54℃,确认AaSOD耐热性能突出,在工业生产中采用常规干燥方式生产,酶活保持率高,生产成本低,适合规模化生产。(2)通过蛋白同源模建,对AaSOD的三维结构进行预测,分析催化中心氨基酸残基与金属离子的作用,并分别构建了 AaSOD中Gln149和Tyr35位点的点饱和突变体库;对各突变体分别结合Fe2+或Mn2+时的活性进行测定和比较,获得4个金属离子偏好性反转的突变体及4个利用Mn2+时活性明显提升的突变体。其中突变体Y35F活性上升幅度最大,在结合Mn2+时比酶活达到1504.5 U/mg,较突变前提高313%,具有较高的开发价值。(3)将AaSOD编码基因经过相应的密码子优化,分别利用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母等模式菌株进行表达并发酵验证,确定枯草芽孢杆菌为适合工业化生产AaSOD的宿主菌株。此外,对所构建枯草芽孢杆菌工程菌株的发酵培养基、发酵工艺及发酵液后处理工艺等系列因素进行优化和设计,最终在30 m3发酵罐上确定了生产SOD的工艺,发酵液中AaSOD酶活性达到6802 U/mL;后续发酵液经离心、膜滤除杂、浓缩、喷雾干燥等工艺获得了酶活为63750 U/g的酶制剂产品(发酵液除菌除杂添加10%糊精喷雾干燥获得),形成了 SOD规模化生产工艺。利用该工艺生产SOD生产成本低,产品质量满足养殖业对饲料用酶制剂要求,具备商业化生产条件。(4)通过建立斑马鱼呕吐毒素感染模型、小鼠呕吐毒素感染模型与小鼠氧化应激肝脏炎症模型,对外源添加SOD缓解动物氧化应激及肝脏炎症的效果进行考察。证明喂食外源SOD能够显著抑制呕吐毒素感染斑马鱼所引成的ROS水平上升,对呕吐毒素感染的小鼠喂食外源SOD能够显著恢复机体抗氧化系统,具体表现为小鼠体重的恢复与SOD、GSH、GSH-PX、CAT、T-AOC的显著上升;改善了肝脏的生理功能,具体表现为显著抑制了肝脏ALT、AST表达量的提高;有助于缓解小鼠的肝脏炎症,具体表现为显著抑制了 IL-1β与IL-6mRNA的表达;转录组学数据显示,SOD的摄入能够显著抑制RAB5IF、hnRNPAB与EndoG的表达,促进IFIT1的表达,抑制肝脏细胞凋亡并缓解肝脏炎症的效果突出。本研究通过挖掘抗逆微生物,筛选到一种适合工业化生产的耐高温耐酸AaSOD酶,在大肠杆菌中表达纯化后,对其酶学性质和关键位点突变特性进行了研究,同时利用利用多种工程模式菌株表达AaSOD,确定了最佳工程宿主菌株及其发酵条件。在此基础上优化生产工艺,利用30 m3发酵罐建立了规模化生产SOD工艺路线,为SOD大规模商业化生产奠定了基础。本研究证明向动物喂食外源SOD对于缓解霉菌毒素引起的动物氧化应激及其引起的炎症反应,恢复受损动物机体抗氧化系统,改善肝脏生理功能效果明显,在国内率先提出了在饲料中添加外源SOD用于抵御饲料中常见的霉菌毒素等引起的动物氧化应激,减少动物炎症反应的观点。研究开发的SOD产业化应用后将产生巨大的社会经济效益。