酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels, ASICs)是一类由胞外酸激活的阳离子通道,开放的通道对Na+、Ca2+有通透性,进而引起细胞一系列生理病理变化。目前为止,已发现4个基因编码的7个ASICs亚基(ASIC1a、ASIC1b、ASIC1b2、ASIC2a、 ASIC2b、ASIC3、ASIC4),均属于DEG/ENaC家族成员。近年来ASICs研究备受关注,其不仅在神经系统中存在表达并发挥疼痛、感觉、神经传递等调节作用,还在非神经系统如肿瘤、炎症、缺血性损伤、胃肠道疾病中发挥作用,这些病理反应中共同的特点是局部组织环境酸化、pH值下降,诱发ASICs激活导致Na+、Ca2+内流,进而引起各种病理生理效应。本课题组前期研究发现SD大鼠关节软骨中存在ASIC1a、ASIC2、和ASIC3的表达,在佐剂性关节炎(Adjuvant Arthritis, AA)大鼠关节软骨中ASIC1a、 ASIC2a和ASIC3的表达均明显高于正常组,ASICs非特异性阻滞剂Amiloride、非甾体类抗炎药阿司匹林能明显抑制。ASICs表达,并对AA大鼠关节软骨具有保护作用。进一步考察ASICs在关节炎中作用机制发现,当大鼠关节炎症发生时,可造成局部关节酸化,ASICs表达增加和通道开放,Ca2+流入关节软骨细胞内,导致关节软骨细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)代谢失衡引起关节软骨损伤。肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是慢性肝病的共同病理过程,是形成肝硬化的中间阶段。目前研究认为,病毒感染和酒精的过量摄入导致肝脏炎症是肝纤维化形成的主因。当炎症刺激时,肝脏产生氧化应激和脂质过氧化损伤,酸性代谢产物增加,肝星状细胞(Hepatic stellate cells, HSCs)活化增殖,转化为肌样成纤维细胞,表达α-SMA,合成和分泌细胞外基质(extracellular matrix, ECM)增加,导致ECM的合成与降解失衡,致使过多的ECM在肝组织沉积形成纤维化。该病理进程与关节炎症类似,即同样存在炎症导致的局部酸化,同样引起ECM代谢的失衡,那么,肝脏是否存在ASICs的表达?当肝纤维化时肝组织的酸性代谢会否导致ASICs的表达增加和通道激活,进而发挥其病理生理学作用?为此,我们研究以下内容：LASICla在大鼠肝组织、肝星状细胞的表达分离大鼠肝组织,RT-PCR检测.ASIC1a mRNA表达,发现大鼠肝组织中存在ASIC1a的表达,CC14诱导的肝纤维化模型大鼠ASIC1amRNA表达增加；采用ASIC1a, α-SMA免疫荧光双标染色模型组大鼠肝组织,发现大鼠肝组织ASIC1a与α-SMA染色区域高度重叠,提示ASIC1a主要表达与活化肝星状细胞。肝灌注分离正常组、模型组大鼠HSC细胞进行RT-PCR, Western blot发现,正常组HSCs存在ASIC1amRNA及其蛋白表达,模型组表达高于正常组。选择HSC-T6表型活化细胞株,用酸诱导HSC-T6体外模型(pH6.0),考察不同pH值环境下ASIC1a在HSC-T6的动态表达,研究发现,与pH7.4组相比,pH6.0酸诱导HSC-T6组ASIC1a表达增加。2. ASIC1a阻滞剂Amiloride对CCI4诱导大鼠肝纤维化的保护作用建立CC14实验性肝纤维化大鼠模型,灌胃给予不同剂量ASIC1a阻滞剂阿米洛利(Amiloride,10,5,2.5mg/kg),观察Amiloride对大鼠肝纤维化的影响,验证ASIC1a在肝纤维化进程中的作用。结果发现,Amiloride能显著抑制肝纤维化大鼠肝、脾指数增加；降低血清中升高的ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、CIⅣ;病理组织学显示Amiloride组肝脏组织结构明显改善,肝纤维化增生程度减轻,提示Amiloride对CC14所致大鼠肝纤维化有明显的保护作用。进一步研究发现,Amiloride可以显著抑制肝组织中ASIC1a的表达,降低肝纤维化大鼠血清中IL-1、IL-6的等炎性因子的含量；抑制肝组织中α-SMA、TGF-β1、NFκB和Collagen I的蛋白表达。研究提示,ASICla参与肝纤维化疾病进程,Amiloride对实验性肝纤维化的保护作用可能与其抑制ASIC1a,进而调节HSCs功能有关。3.ASICla对酸诱导HSC-T6细胞内Ca2+浓度、细胞增殖和基质代谢的影响建立酸诱导HSC-T6体外模型,采用Amiloride、ASIC1a特异性阻滞剂PcTX1干预,考察抑制ASICla对HSC-T6细胞胞内Ca2+浓度、细胞增殖及基质代谢的影响。激光共聚焦显微镜、Ca2+成像研究HSC-T6胞内Ca2+的变化发现,pH6.0能明显促进Ca2+流入HSC-T6胞内,Amiloride、PcTX1干预后,Ca2+内流明显减少；MTT法观察ASIC1a阻滞剂对酸诱导HSC-T6的细胞增殖的影响,与pH6.0组相比,Amiloride (200、100、50μM)、PcTX1干预后,HSC-T6细胞生长明显被抑制,且呈剂量效应关系；研究HSC-T6功能的影响,发现与pH7.4组相比,酸处理至pH6.0HSC-T6细胞中α-SMA、TGF-β1、collagen Ⅰ表达增加,Amiloride、PcTXl干预后α-SMA、TGF-β1collagen I表达降低。进一步观察发现,pH6.0HSC-T6细胞中MMP-13明显降低,TIMP-1明显上调,Amiloride、PcTX1能抑制酸性环境下TIMP-1的增加,升高被降低的MMP-13含量,MMP-9、TIMP-2在酸诱导HSC-T6含量变化不明显。研究提示,ASIC1a参与HSCs功能和代谢过程,当酸刺激下,ASIC1a激活和通道开放,使HSC-T6细胞Ca2+内流增加,进而调节HSC-T6细胞生长和胶原分泌,其调节胶原代谢的过程还与MMP-13、TIMP-1的变化有关。4. MAPK信号通路在ASIC1a调节HSC功能中的作用建立酸诱导HSC-T6体外模型,采用ASIC1a非特异性阻滞剂Amiloride、ASIC1a特异性阻滞剂PcTX1、p38MAPK阻断剂SB203580、ERK1/2阻断剂PD98059干预,考察MAPK信号通路在ASIC1a调节HSC功能中的作用。研究结果显示,ASIC1a激活可影响大鼠HSC-T6细胞磷酸化p38MAPK和磷酸化ERK1/2蛋白表达;Amiloride、 PcTX1、p38MAPK阻断剂SB203580、ERK1/2阻断剂PD98059不同程度抑制p38MAPK和磷酸化ERKl/2蛋白表达；进一步研究发现,p38MAPK阻断剂、ERK1/2阻断剂不影响酸诱导HSC-T6细胞中Ca2+的流入,但p38MAPK阻断剂、ERK1/2阻断剂均能降低collagen I mRNA的表达,其调控机制与p38MAPK调控MMP-13、ERK调控TIMP-1的表达水平有关。结果提示胞外酸化激活ASIC1a通过激活Ca2+依赖的ERK调控TIMP-1的代谢和Ca2+依赖的p38MAPK调控MMP-13的代谢发挥HSC-T6胶原代谢的调节作用。小结：肝组织、HSC细胞中存在ASICla表达,模型组大鼠肝组织、HSC细胞ASICla表达升高；阻滞ASICla对肝纤维化有保护作用；ASICla参与HSCs功能和胶原代谢过程,当ASICla激活时,可增加HSC的Ca2+内流,进而促进HSC细胞因子TGB-∞1生成和胶原分泌,同时TIMP-1上调,MMP-13下降,抑制胶原降解；MAPK信号通路参与ASICla调节HSC胶原代谢的过程。