阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD),又称老年性痴呆病[1],是一种进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病,出现的全面持久的智能减退,包括记忆力、判断力、计算力、思维能力和语言功能的减退,丧失独立工作能力和生活能力。其病理变化主要表现为脑内胆碱能神经元的原发性变性和减少、β样淀粉样蛋白沉积脑内所形成的老年斑以及神经原纤维缠结。随着人类寿命的延长,全球进入老龄化社会。目前AD已成为继癌症、心血管疾病和中风之后威胁老年人健康的又一大疾病。我国的流行病学调查资料显示,AD在65岁以上人群中的发病率为3%-5%,接近西方发达国家水平。衰老、基因突变及遗传为AD明确的致病原因,此外炎症及应激,神经递质减少,代谢异常等都为其可能的致病原因[2-3]。AD至今无有效的治疗方法,目前主要是对症治疗。多年以来,乙酰胆碱酯酶抑制剂如加兰他敏、石杉碱甲,谷氨酸受体调控剂如盐酸美金刚胺,脑循环改善剂如尼麦角林等,γ-氨基丁酸类促智药如吡拉西坦等被广泛应用于AD的治疗[4-7]。但由于AD病人需要长期服药,西药的副作用比较大,不断寻求副作用小的药物以有效地治疗AD成为现代社会人们广泛关注的重要问题。脏腑失调,气血亏虚,脑髓失养是形成AD的必要条件,肾之精气化精生髓汇聚而为脑,五脏气血之精华皆上荣于脑,脑髓之功能发挥,须依赖气血滋养。老年人脏腑功能失调,气血生化乏源,脑髓得不到充足的气血滋养,久则神明受损,功能低下。中药当归芍药散具有整体作用的特点,与临床常用的抗老年性痴呆化学药物相比,它们的副作用比较小,不易产生耐药性,有明显前景和优势[8-10]。当归芍药散(DangguiShaoyao San,以下简称DSS)是《金匮要略》所载著名方剂[1],由当归、芍药、川芎、茯苓、白术、泽泻(1：5.3：2.6：1.3：1.3：2.6)六味药组成。当归具有补血活血,调经止痛,润肠通便的功效。芍药有养血敛阴,补而不腻,柔肝缓中,止痛收汗功效。当归芍药散具有养血调肝,健脾利湿,养血益脾等功效。原方主治“妇人妊娠诸疾痛”以及“妇人杂病腹中诸疾痛”。目前有研究将DSS转变为治疗老年性痴呆的有效方剂,疗效确切[12-14]。前期的研究基础：本课题在国家自然基金“当归芍药散化学成分、剂量配比与药效学关系”的研究项目资助的支持下,采用现代药理研究方法,研究当归芍药散的抗痴呆作用。采用D-半乳糖致致小鼠亚急性衰老的经典动物模型,考察了当归芍药散及单味药材提取液对动物神经系统的影响[15-17],结果发现当归芍药散能显著改善学习记忆能力。中药方剂是中医临床治疗疾病的主要手段,药物的合理配伍可以相使相须,达到一种优化组合的整体疗效。当归芍药散的抗老年痴呆作用与其组方药材有着密切的关系,又非这些药材中化学成分的简单加和。基于以上原因,研究设计将中药化学、质量控制以及药理学技术紧密结合,以确定当归芍药散抗老年痴呆作用的物质基础。目的在抗老年痴呆药理活性指导下,对当归芍药散(DSS)(当归、芍药、川芎、茯苓、白术、泽泻(1：5.3：2.6：1.3：1.3：2.6))药效物质的提取工艺、化学成分及其含量分析、指纹图谱、化学成分在动物体内代谢等进行了相关研究,旨在为当归芍药散的二次开发提供科学依据。方法采用药理学实验研究方法,对当归芍药散水提和醇提部位进行了抗老年痴呆的药理筛选研究。建立D-半乳糖联合AlCl3所致亚急性衰老小鼠的模型,考察各组小鼠体重变化,统计各组小鼠八臂迷宫的工作记忆错误次数、参考记忆错误次数、错误总数次数。采用Lg(34)正交表对抗痴呆药效最好的当归芍药散醇提部位(以下简称当归芍药散)的提取工艺进行了研究。因素选择：乙醇浓度(A)、提取次数(B)、提取时间(C)、乙醇用量(D),每个因素设置3个水平。选择多指标成分芍药苷、阿魏酸、川芎嗪、白术内酯Ⅰ、藁本内酯进行综合测评,确定各因素的最佳提取工艺水平。在此基础上,采用系统溶剂分离法,对当归芍药散(DSS)进行了部位分离,分离了石油醚部位(DSS-P)、乙酸乙酯部位(DSS-E)、正丁醇部位(DSS-N)、水部位(DSS-W),以进行化学成分和药效学研究。建立了当归芍药散(DSS)及4个部位的主要活性成分芍药苷、阿魏酸、川芎嗪、白术内酯Ⅰ、藁本内酯进行了HPLC-DAD含量分析方法。色谱条件为：色谱柱syncronisC18(4.6mm×250mm,5μm)不锈钢柱；流动相：A：乙腈,B：0.1%磷酸,梯度程序条件洗脱；流速：1.Oml/min;柱温：30C°；进样体积：10μL；用二极管检测器进行190nm-400nm全波长扫描,经比较后发现220nm、270nm、320nm处基线平稳,出峰多,峰强度较好,故确定检测波长为220nm、270nm、320nm。λ1=220nm(检测芍药苷),λ2=270nm(检测川芎嗪、白术内酯Ⅰ),λ3=320nm(检测藁本内酯、阿魏酸。对当归芍药散进行了指纹图谱的研究,标定了共有峰,采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行相似度分析,建立当归芍药散的三波长融合指纹图谱,使用化学对照品和药材对色谱峰进行定性、归属。药效试验采用体内结合体外研究方法,对当归芍药散(DSS)及石油醚部位(DSS-P)、乙酸乙酯部位(DSS-E)、正丁醇部位(DSS-N)、水部位(DSS-W)进行了抗痴呆筛选研究。(1)利用D-半乳糖联合AlCl3造成小鼠老年痴呆病理的复合模型,出现学习记忆力减退；海马和皮质老年斑形成,促进Aβ的沉积等类似AD病变,造模机制比较接近AD。用八臂迷宫研究动物的行为学变化,检测其生化指标(SOD、MDA、GSH-Px、脂褐素),HE染色观察脑组织病理形态学等方面对当归芍药散及四个部位进行了研究；(2)采用体外清除1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)法对当归芍药散(DSS)及其部位进行抗氧化研究。当有自由基清除齐(?)DPPH存在时,由于与DPPH的单电子配对而使其吸收逐渐消失,其褪色程度与配对电子数成化学计量关系,因而可用分光光度法进行定量分析；(3)选用与多巴胺能神经元有许多相似特征的PC12细胞为实验对象,以过氧化氢(H2O2)诱导PC12细胞损伤,从而建立体外多巴胺能细胞的AD氧化应激模型,研究当归芍药散(DSS)及部位的保护作用,包括：H2O2作用时间和浓度的选择、当归芍药散(DSS)对细胞毒性考察和浓度的选择、当归芍药散(DSS)对细胞存活率的影响。用倒置显微镜观察培养的PC12细胞的形态,用形态学方法证明PC12细胞培养成功。采用150、200、250、300、350、400、450μg/ml浓度的当归芍药散(DSS)分别与PC12细胞共同孵育24h,以MTT法测定细胞存活率。考察当归芍药散对过氧化氢(H202)诱导PC12细胞活性的影响,不同剂量当归芍药散(100、150、200、250、300、350、400μg/ml预孵育PC12细胞2h,再和H2O2共培养6h,以MTT法测定细胞存活率；采用剂量相当于当归芍药散(DSS)(300μg/ml)的各个部位预孵育PC,2细胞2h,再和H2O2共培养6h,以MTT法测定细胞存活率。(4)当归芍药散(DGS)的化学成分与药效相关性研究,利用本章药效实验数据与第二章质量控制的HPLC实验数据,将当归芍药散、乙酸乙酯、正丁醇、水部位得到的化学成分对应的色谱图中各色谱峰Xi与本章药效实验数据(变量Y(Y1：小鼠42天体重增长鼠；Y2：八臂迷宫RME错误次数；Y3：八臂迷宫WME错误次数； Y4：八臂迷宫错误总次数；Y5：八臂迷宫时间；Y6：小鼠血浆SOD含量；Y7：小鼠血浆MDA含量；Y8：小鼠血浆GSH-Px含量；Y9：小鼠脑内脂褐素的含量；Y10：对DPPH清除的影响；Y11：对PC12的存活率))进行相关性统计分析,研究当归芍药散化学成分与药效之间的关系。基于LC/MS/MS技术分析当归芍药散在大鼠血液和组织中指标性成分,观察其代谢的化学成分谱变化。(1)建立的多成分LC/MS/MS法分析方法学认证的基础上,对单次口服当归芍药散(18g(生药)/Kg)后的大鼠血浆中多种成分的药代动力学进行了初步的研究,考察成分的药代动力学参数。色谱及质谱条件色谱柱为Eclipse XDB C18柱(3.5μm,2.0mm×150mm),流动相为甲醇：10mmol·L-1乙酸铵(90：10),流速为200μL·min-1,样品进样量为20μL,柱温：35℃,分析时间为3.0min,用外标法进行定量分析。采用辅助气化电喷雾离子源(ESI)正离子和负离子分时段监测模式(MRM)进行定量分析,0-2.8min时段负离子监测离子对为：m/z478.9→448.9(芍药苷)和m/z192.8→177.8(阿魏酸),2.8-6min时段正离子监测离子对为：m/z231.4→185.1(白术内酯-Ⅰ)。离子源的雾化气和气帘气均为氮气,流量分别为70、30mL·min-1、碰撞气(氮气)流量为12L·min-1,离子源喷雾电压：-4500V/+4500V,雾化温度：450℃。(2)单次口服当归芍药散(18g(生药)/Kg)后,建立了大鼠的组织样品中当归芍药散多成分的LC/MS/MS分析方法,灌胃当归芍药散给大鼠后,参考芍药苷和阿魏酸血药浓度—时间曲线,确定采样时间点为15min,35min和6h。SD大鼠15只,每组5只,随机分为3组。灌胃当归芍药散后分别于给药后的15min,35min和6h,将大鼠迅速颈椎脱臼处死,分离胃,肠,肺,肾,脑,心,肝,脾等组织(胃,肠组织分别用蒸馏水将内容物冲洗于净,用干燥滤纸吸干),共8种组织。分别进行LC/MS/MS定量分析。阐明当归芍药散多成分在各组织中的分布特点及组织中药物浓度随时间的变化规律。统计数据均用SPSS13.0统计分析软件处理,显著性水平取α=0.05(双侧),P<0.05为差异有统计学意义。结果1.提取工艺的研究在当归芍药散对D-半乳糖联合AlCl3所致亚急性衰老小鼠的影响实验中发现：42d检测行为学实验结果：与模型组比及当归芍药散醇提部位组(高、低剂量)和水提部位组(高、低剂量)均使小鼠在走完八臂迷宫所用时间、小鼠工作记忆错误、参考记忆错误、错误总数减少,有显著性差异(P<0.05)。各给药组间比较,当归芍药散醇提部位组高剂量(40g/Kg)(以下简称当归芍药散)表现最好。在确认改善AD小鼠学习能力效果最好的是DSS乙醇浸膏高剂量的药效活性指导下,采用(L34)正交设计实验对当归芍药散的乙醇提取工艺进行了研究,选择多指标芍药苷、阿魏酸、白术内酯、川芎嗪、藁本内酯为定量指标进行综合测评。依据方差分析结果：A、B、D因素均对实验结果差异有显著性(P<0.05),A2优于A1和A3；B2优于B1和B3；D2优于D1和D3,各因素影响程度依次为A>B>D>C,再结合直观分析结果和实际情况综合考虑,确定各因素的最佳水平组合为A2B2C3D2,采用70%乙醇,提取2次,提取3小时,乙醇用量8倍。2.当归芍药散质量控制的研究采用HPLC-DAD法分别对当归芍药散(DSS)及石油醚部位(DSS-P)、乙酸乙酯部位(DSS-E)、正丁醇部位(DSS-N)、水部位(DSS-W)的主要活性成分芍药苷、阿魏酸、川芎嗪、白术内酯Ⅰ、藁本内酯进行了含量分析研究,芍药苷lgy=0.97381gx+5.968,r=0.9996,含量在3.46-34.6μg范围内线性关系良好；阿魏酸1gy=1.01971gx+6.728,r=0.9999,含量在0.174-1.74μg1范围内线性关系良好；川芎嗪1gy=0.99731gx+6.105,r=0.9994,含量在5.1-51.0u g范围内线性关系良好；白术内酯Ⅰ1gy=0.16261gx+6.687,r=0.9990,含量在0.952-9.52μg范围内线性关系良好；藁本内酯1gy=0.98161gx+5.161,r=0.9992,含量在8.24-82.4μg范围内线性关系良好。其中当归芍药散中5种成分测定结果分别为：芍药苷5.945mg/g、阿魏酸0.042mg/g、川芎嗪3.930mg/g、白术内酯Ⅰ0.7200mg/g、藁本内酯1.470mg/g；石油醚部位中白术内酯10.1790mg/g、藁本内酯0.8770mg/g；乙酸乙酯部位中芍药苷1.261mg/g、阿魏酸0.037mg/g、川芎嗪3.045mg/g；正丁醇部位中芍药苷2.801mg/g、阿魏酸0.0040mg/g、川芎嗪0.9940mg/g；水部位中芍药苷0.2080mg/g、川芎嗪2.497mg/g。5种成分的含量特点：芍药苷：DSS>DSS-N>DSS-E>DSS-W:阿魏酸：DSS>DSS-E>DSS-N:川芎嗪：DSS>DSS-E>DSS-W>DSS-N>DSS-P:白术内酯Ⅰ：DSS>DSS-P:藁本内酯：DSS>DSS-P。建立了该当归芍药散的三波长(220nm,270nm,320nm)融合指纹图谱,10批样品230nm指纹图谱有30个共有峰,270nm处有25个共有峰,320nm处有20个共有峰。三波长融合指纹图谱共有32个共有峰,在峰数及含量上兼顾三个特征波长指纹的特点。标定5个对照品芍药苷、阿魏酸、川芎嗪、白术内酯Ⅰ、藁本内酯的色谱峰,标定了共有峰32个,方法分离度好,重现性和稳定性良好。其中0-68min为220nm波长下的指纹图谱、270nm波长下的指纹图谱,68-90min为320nm波长下的指纹图谱。3.药效试验采用体内结合体外研究方法,对当归芍药散及石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位进行了抗衰老筛选研究。(1)第7d各组小鼠体质量增长数有明显统计学差异(P<0.05)。第14d与阳性组比模型组的质量增长数显著性增加(P<0.01),第21d时,与空白组比较,模型组体质量增长数减少(P<0.01)；与模型组比较,当归芍药散及各部位组体质量增长数增加(P<0.05);42d时与空白组比,模型组体质量增长数减少,有明显统计学差异(P<0.01),与模型组比较,当归芍药散组及各部位组体质量增长数增加(P<0.01或P<0.05)。行为学实验结果：模型组小鼠走完八臂迷宫所用时间、小鼠工作记忆错误次数、参考记忆错误次数、错误总次数高于空白组(P<0.01),造模成功；当归芍药散组及石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位组小鼠走完八臂迷宫所用时间、工作记忆错误、参考记忆错误、错误总数少于模型组(P<0.01),各给药组间比较,各部位组中乙酸乙酯组和正丁醇组为最好。生化指标(SOD、MDA、GSH-Px、脂褐素)检测结果表明：与空白组比模型组SOD活性明显降低(P<0.01)。与模型组比各个部位明显升高损伤的小鼠血中SOD活性,尤其以当归芍药散和乙酸乙酯部位最好。与空白组比模型组MDA活性明显升高(P<0.01)。与模型组比各个部位明显升高损伤的小鼠血中MDA,差异均具有显著性意义(P<0.01)。尤其以当归芍药散和乙酸乙酯部位最好。与空白组比模型组GSH-Px活性明显降低(P<0.01)。与模型组比各个部位明显升高损伤的小鼠血中GSH-Px活性,差异均具有非常显著性意义(P<0.01)。尤其以当归芍药散、乙酸乙酯部位、正丁醇部位最好。脑内脂褐素结果表明：与空白组比模型组脂褐素明显升高(P<0.01)；与模型组比当归芍药散及各部位明显降低小鼠脑中脂褐素的含量。HE染色的一般形态学光镜下观察：①空白组小鼠皮质区神经细胞结构正常,数量较多,胞核清晰,胞浆丰富,间质无水肿表现,胶质细胞散布于神经细胞之间；海马区锥体细胞层排列紧密,细胞核圆而大,核仁清晰。②模型组皮质区神经细胞减少和胶质细胞增多、细胞排列稀疏、杂乱、有的细胞核固缩、细胞线不清晰,核仁消失,胞浆深染；海马区锥体细胞层数减少,排列稀疏不规则,细胞体积变小,可见核固缩现象。③与模型组比当归芍药散组、乙酸乙酯组、正丁醇组比有明显改善,小鼠皮质区细胞结构排列较整齐、紧密、细胞核可见；皮质区仍有不同程度的神经细胞变性.但变性神经细胞数量明显减少,可见少部分损伤细胞,细胞形态趋于正常,海马区锥体细胞形态、排列基本正常。(2)由当归芍药散及各部位对DPPH自由基的清除率作曲线可知,当归芍药散、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物的IC50值分别为0.3518,1.012、1.133、1.371mg/mL,石油醚无IC50值。清除DPPH自由基能力的大小顺序依次为：当归芍药散>乙酸之酯部位>正丁醇部位>水部位>石油醚部位。但是溶液质量浓度在2mg/mL以上时当归芍药散与乙酸乙酯部位清除率接近。(3)采用不同浓度的当归芍药散的结果发现：与正常细胞比当归芍药散在400、450μg/ml时对PC12细胞明显毒性作用(P<0.05)。不同浓度当归芍药散可拮抗H2O2的作用,细胞存活率明显升高,各剂量下细胞存活率分别为120%、128%、129%、126%、100%、59%、51%,具有明显的剂量相关性(P<0.001),与正常对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。采用剂量相当于当归芍药散(300μg/m1)的各部位均可拮抗H,O,的作用,细胞存活率明显升高,与模型组比较差异均具有统计学意义(P<0.05),但是各部位之间无明显差异,有可能当归芍药散在全方整体角度表现出对神经细胞的保护作用。(4)当归芍药散的化学成分与药效相关性研究发现Pearson分析和灰色关联度分析表明：前面所述5个已知指标性成分芍药苷,阿魏酸,川芎嗪,藁本内酯,白术内酯Ⅰ与药效具有高度相关性。4.当归芍药散大鼠体内多成分的药代动力学研究本实验采用LC/MS/MS法测定各时间点血浆中芍药苷、阿魏酸的含量,灵敏度高、快速、简单、准确、分析时间短,在5分钟内出峰完毕,重现性好,可用于大鼠血浆中芍药苷、阿魏酸的定量,其它成分未能检出,可能是因为该测定方法灵敏度不够高,或可能是这些成分在大鼠体内转化成其他物质有待今后进一步研究。大鼠单次灌胃当归芍药散后,芍药苷的吸收和消除十分迅速,在给药后的血浆中能很快测出较高浓度的芍药苷(大鼠的Cmax出现在前0.5h),药-时曲线呈现双峰现象,约在8-10h出现第2个峰值(浓度低于第1个峰值)。表明该成分体内吸收较快,药物在体内消除较快,半衰期为5.0±1.4h。大鼠灌胃当归芍药散后,在大鼠体内芍药苷和阿魏酸各组织分布高低顺序如下(1)大鼠体内15min时各组织中芍药苷浓度顺序为：胃>肝>肺>肠>心>血>肾>>脑：(2)大鼠体内35min时各组织中芍药苷浓度顺序为：胃>血>肺>肠>肾>肝>心>>脑：(3)大鼠体内6h时各组织中芍药苷浓度顺序为：胃>血>肠>肾>肝≈肺≈心>脑。(4)大鼠体内15min时各组织中阿魏酸浓度顺序为：胃>肠>肝>肺>心>血>肾≈脑：(5)大鼠体内35min时各组织中阿魏酸浓度顺序为：胃>肠>肺>>脑>肝>肾>血>心：(6)大鼠体内6h时各组织中阿魏酸浓度顺序为：胃>肠>肺>肾>血。大鼠灌胃当归芍药散后,当归芍药散可迅速分布于全身大多数组织脏器,大鼠5min时各组织芍药苷和阿魏酸浓度达到峰值,这与血药浓度-时间曲线变化一致。6h时大鼠各组织中芍药苷和阿魏酸浓度降至不足峰值时的10%。当归芍药散在大鼠中芍药苷和阿魏酸均以胃肠道中含量最高,脑中含量最低,相对芍药苷来说阿魏酸的组织消除速率比较慢。结论研究综合采用化学指纹图谱、药效学、药代动力学等联合研究的模式证明了当归芍药散抗衰老的作用机制。化学指纹图谱：采用HPLC-DAD法分别对当归芍药散及石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位的主要指标性成分芍药苷、阿魏酸、川芎嗪、白术内酯Ⅰ、藁本内酯进行了含量分析研究。发现当归芍药散及各部位中各种成分的含量各有高低。建立了该当归芍药散的三波长(220nm,270nm,320nm)融合指纹图谱,标定5个对照品芍药苷、阿魏酸、川芎嗪、白术内酯Ⅰ、藁本内酯的色谱峰,标定了共有峰32个,方法分离度好,重现性和稳定性良好,为药效研究提供质量保证。药效学实验：证明当归芍药散能明显改善D-半乳糖联合Alcl3所致亚急性衰老小鼠行为学的异常和空间认知障碍,提高学习记忆能力；减少自由基对脑组织的氧化损害;改善病理因素造成的实验动物脑内组织形态的异常。体外抗氧化实验证实其抗氧化能力的大小顺序依次为：当归芍药散>乙酸乙酯部位>正丁醇部位>水部位>石油醚部位。体外PC12细胞实验证明当归芍药散和各部位可拮抗H2O2的作用,细胞存活率明显升高,但是各部位之间无明显差异,有可能当归芍药散在整体角度表现出对神经细胞的保护作用。药代动力学研究表明：大鼠体内血浆芍药苷阿魏酸等是当归芍药散抗痴呆活性的主要有效组分。给大鼠灌胃当归芍药散后,当归芍药散可迅速分布于全身大多数组织脏器,大鼠5min时各组织芍药苷和阿魏酸浓度达到峰值,当归芍药散在大鼠中芍药苷和阿魏酸均以胃肠道中含量最高,脑中含量最低,相对芍药苷来说阿魏酸的组织消除速率比较慢。当归芍药散的化学成分与药效相关性研究发现Pearson分析和灰色关联度分析表明：前面所述5个已知指标性成分芍药苷,阿魏酸,川芎嗪,藁本内酯,白术内酯Ⅰ与药效具有高度相关性,结合药代动力学结果在实验角度阐明这5个指标性成分作为药效物质基础的科学性。