论文部分内容阅读
目的:骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种最常见的关节疾病,主要特点是关节软骨变性和继发性骨质增生,最终导致关节功能障碍和残疾。近年来,肥胖在全球范围内的急剧增加已经成为OA增加的重要原因之一,而肥胖引起的慢性低度炎症状态与OA的发生发展密切相关。Toll样受体4(Toll like receptors 4,TLR4)是天然免疫受体家族中的一员,TLR4介导的信号通路在肥胖相关OA的发生发展过程中起至关重要的作用,抑制TLR4信号通路可发挥抗肥胖相关OA效应。白藜芦醇(Resveratrol,RES)是一种天然的植物多酚类化合物,具有抑制凋亡、抗炎和抗氧化作用。我们先前研究发现白藜芦醇的抗肥胖相关OA效应与抑制TLR4/NF-κB信号通路有关,但其确切调控机制目前还不十分清楚。研究发现,内源性叉头框转录因子O1(Forkhead box O1,FoxO1)对于保持正常的TLR4水平是必需的,在巨噬细胞中,FoxO1可以结合到TLR4基因的多个增强子原件,上调TLR4的表达,从而增强TLR4信号,而后者则诱导丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt),引起FoxO1发生磷酸化而失活,从而形成炎性自限机制,提示在肥胖状态下的OA软骨细胞中也可能存在TLR4/Akt/FoxO1轴的自限机制,通过增强该负反馈作用有助于改善OA的炎症状态。因此,本研究通过体内、外实验,探讨TLR4/Akt/FoxO1轴在肥胖相关OA中的作用及白藜芦醇是否通过增强TLR4/Akt/FoxO1的自限性来下调TLR4的表达,进而引起NF-kB失活,最终改善肥胖相关OA软骨细胞的炎症状态,为肥胖相关OA的营养防治提供新的靶点。研究方法:1、动物分组及处理:60只C57BL/6雄性小鼠(18-22g,7周龄)按体重随机分为对照组(CON)、高脂组(HFD)、白藜芦醇处理组(HFD+RES)。对照组喂食基础饲料,高脂组和白藜芦醇处理组喂食高脂饲料。对照组和高脂组给予0.5%羧甲基纤维素钠(CMC)水溶液灌胃;白藜芦醇处理组给予0.5%CMC与白藜芦醇(45mg/kg/d)混悬液灌胃,各组小鼠均自由进食和饮水,共计22周。实验期末,处死小鼠,取膝关节用于后续检测。2、各组小鼠膝关节病理学改变及评价:(1)各组小鼠膝关节HE、番红O和番红O-固绿染色;(2)各组小鼠膝关节Mankin评分;(3)小鼠关节软骨Ⅱ型胶原的表达:免疫组化检测各组小鼠膝关节软骨组织中Ⅱ型胶原表达情况。(4)小鼠关节软骨MMP13 mRNA及蛋白表达:采用Real-time RCR及Western blot法检测。3、TLR4/Akt/FoxO1轴相关基因及蛋白在小鼠关节软骨中的表达情况:(1)Real-time RCR法检测关节软骨TLR4 mRNA表达;(2)Western blot法检测小鼠膝关节软骨中TLR4、MyD88、TRIF、IL-1β、p-NF-κB p65、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、FoxO1和p-FoxO1蛋白表达水平;(3)关节软骨免疫荧光染色:采用免疫荧光方法检测关节软骨p-Akt的表达及FoxO1的核定位情况。4、细胞分组及处理:选用SW1353细胞系,分为(1)CON组(含2‰DMSO)、IL-1β组(10 ng/ml)、IL-1β+RES组(IL-1β:10 ng/ml,RES:50μmol/L),Western blot法检测TLR4、MyD88、TRIF、p-NF-κB p65、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、FoxO1和p-FoxO1蛋白表达水平;(2)CON组(含2‰DMSO)、IL-1β(10 ng/ml)或RES(50μmol/L)组,分别选择不同时间点处理细胞,Western blot检测PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、FoxO1和p-FoxO1蛋白表达水平,确定后续细胞处理时间。5、TLR4基因沉默、TLR4抑制剂CLI-095、PI3K抑制剂LY294002和FoxO1基因沉默分别处理细胞,检测相关蛋白的表达:(1)TLR4或FoxO1基因沉默:荧光法检测转染效率,Western blot法检测沉默效率;(2)TLR4基因沉默:Western blot法检测TLR4、MyD88、TRIF、p-NF-κB p65、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、FoxO1和p-FoxO1蛋白表达水平;(3)TLR4抑制剂、PI3K抑制剂和FoxO1基因沉默:Western blot法检测TLR4、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、FoxO1和p-FoxO1蛋白表达水平。6、细胞培养上清中IL-6的水平:采用ELISA法检测。7、采用SPSS 13.0软件进行统计分析,实验所得数据以平均值±标准差((?)±s)表示,组间的差异由单因素方差分析(ANOVA),两两比较采用最小显著差异法(LSD),P<0.05时差异有统计学意义。结果:1、在整个实验期内,各组小鼠体重均有增加,体重和体脂百分比第22周时HFD和HFD+RES组明显高于CON组(P<0.01),而HFD和HFD+RES组两组间差异无统计学意义。2、小鼠膝关节软骨病理学结果显示,CON组软骨组织表面平整,软骨细胞排列规则整齐,潮线清晰、完整;HFD组软骨组织表面略有损伤,软骨细胞数量局部减少,潮线颜色变浅,偶见潮线缺失;而白藜芦醇处理抑制了HFD组病理学改变。Mankin评分结果显示,HFD组Mankin评分明显高于CON组(P<0.01);与HFD组比较,HFD+RES组Mankin评分明显下降(P<0.01)。3、小鼠关节软骨Ⅱ型胶原蛋白表达显示,与CON组比较,HFD组Ⅱ型胶原蛋白表达明显减少;与HFD组比较,HFD+RES组Ⅱ型胶原蛋白表达升高。平均光密度分析结果显示,与CON组比较,HFD组和HFD+RES组平均光密度值明显下降(P<0.01);与HFD组比较,HFD+RES组平均光密度值明显升高(P<0.01)。4、Western blot结果显示,与CON组比较,HFD组和HFD+RES组MMP13mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.01,P<0.05);与HFD组比较,白藜芦醇处理可下调其表达(P<0.01)。与CON组比较,HFD组和HFD+RES组TLR4 mRNA及蛋白、MyD88、TRIF、p-NF-кB p65和IL-1β蛋白的表达水平显著升高(P<0.01,P<0.05);与HFD组比较,白藜芦醇处理可使其表达下调(P<0.05,P<0.01)。5、与CON组比较,HFD组和HFD+RES组PI3K、Akt及FoxO1的磷酸化表达水平显著升高(P<0.05,P<0.01);与HFD组比较,白藜芦醇处理后其磷酸化表达水平进一步上调(P<0.05)。小鼠关节组织的免疫荧光及荧光强度分析发现,HFD组和HFD+RES组p-Akt的红色荧光强度高于CON组(P<0.01),与HFD组比较,HFD+RES组p-Akt的荧光强度进一步升高(P<0.05);小鼠关节FoxO1的免疫荧光发现,HFD组和HFD+RES组FoxO1的红色荧光在细胞浆有表达。6、IL-1β可激活SW1353细胞TLR4、MyD88、TRIF和p-NF-κB p65(P<0.01),白藜芦醇的处理可显著下调这些蛋白的表达水平(P<0.05,P<0.01);IL-1β可使SW1353细胞p-PI3K、p-Akt和p-FoxO1表达水平升高(P<0.01),白藜芦醇的处理可进一步上调p-PI3K、p-Akt和p-FoxO1的表达水平(P<0.01);IL-1β组SW1353细胞培养上清液中IL-6浓度明显上调(P<0.01),白藜芦醇的处理显著降低IL-6水平(P<0.01)。7、IL-1β(10ng/ml)或白藜芦醇(50μmol/L)不同时间处理SW1353细胞对PI3K、Akt及FoxO1总蛋白表达水平无明显影响;而IL-1β(10 ng/ml)或白藜芦醇(50μmol/L)不同时间处理SW1353细胞可使p-PI3K、p-Akt及p-FoxO1的蛋白表达量增多,表达高峰期集中在30min(P<0.01)。8、TLR4基因沉默后,IL-1β组或IL-1β+RES组SW1353细胞MyD88、TRIF和p-NF-κB p65的表达水平均显著下降(P<0.05,P<0.01)。9、TLR4信号通路抑制剂CLI-095处理细胞后,IL-1β组或IL-1β+RES组细胞PI3K、Akt及FoxO1磷酸化蛋白表达量显著下降(P<0.01);CLI-095显著下调IL-1β组细胞培养上清液中IL-6的水平(P<0.01),白藜芦醇处理后进一步降低了IL-6水平(P<0.01)。10、TLR4基因沉默后,IL-1β组或IL-1β+RES组SW1353细胞PI3K、Akt及FoxO1的磷酸化水平显著下降(P<0.01);IL-1β组细胞培养上清液中IL-6的水平显著降低(P<0.01),白藜芦醇处理后进一步降低了IL-6水平(P<0.01)。11、PI3K抑制剂LY294002处理细胞后,IL-1β组或IL-1β+RES组细胞p-PI3K、p-Akt和p-FoxO1蛋白表达量显著减少(P<0.01),而TLR4蛋白表达量显著上调(P<0.01);LY294002显著上调IL-1β组或IL-1β+RES组细胞培养上清液中IL-6的水平(P<0.01)。12、FoxO1基因沉默后,IL-1β或IL-1β+RES组细胞p-PI3K、p-Akt和TLR4的蛋白表达显著减少(P<0.01);IL-1β组细胞培养上清液中IL-6的水平显著降低(P<0.01),白藜芦醇处理后进一步降低了IL-6水平(P<0.01)。结论:1、高脂膳食喂养C57BL/6小鼠可以引起肥胖相关OA,经口给予白藜芦醇可以抑制高脂膳食诱导的小鼠肥胖相关OA的发生。2、白藜芦醇发挥的抗肥胖相关OA效应与抑制TLR4/NF-κB信号通路包括MyD88依赖性及非依赖性途径,激活PI3K/Akt信号通路以及失活FoxO1有关。3、肥胖相关OA软骨细胞存在TLR4/Akt/FoxO1炎症自限机制,白藜芦醇通过增强该自限作用发挥抗OA效应,即:白藜芦醇通过激活PI3K/Akt信号通路,引起FoxO1失活,而失活的FoxO1下调TLR4表达,进而抑制TLR4/NF-κB信号通路来发挥抗OA效应。