第一部分自噬在成牙本质细胞抵御炎症中的作用研究目的:成牙本质细胞是神经嵴来源的间充质细胞,组成抵御细菌侵袭的一道重要防线。龋病进展过程中,牙体硬组织受到破坏,致龋菌及其分泌产物通过成牙本质小管入侵,成牙本质细胞产生炎症与免疫反应,同时促进自身分泌活动形成反应性牙本质抵御病变进展。这个过程中成牙本质细胞是通过何种机制使细胞具备抵御外界应激的能力,促进细胞存活,减少细胞死亡呢?自噬是细胞通过降解自身长蛋白和受损细胞器,实现物质和能量循环利用,维持细胞稳态的一种重要的生存机制。此部分我们探讨了炎症微环境中自噬在成牙本质细胞中发挥的作用。研究方法:LPS刺激前成牙本质细胞系mDPC6T,使用CCK8检测24h内不同时间点细胞的活力,western blot检测24h内对照组和LPS处理组的自噬相关蛋白p-ULK1S555、LC3、Atg5-Atg12,和自噬的上游信号分子p-AMPKαT172的表达,以及凋亡指标Cleaved caspase3的表达。同时使用LC3的细胞荧光进一步验证LPS刺激下6h时LC3斑点在两组的表达,并做统计学分析检测两组阳性细胞数。使用自噬的抑制剂CQ处理后,CCK8检测细胞的活力,western blot检测Akt/survivin的表达水平。同时使用LY294002和YM155分别抑制Akt的激活和survivin的表达,检测自噬相关指标的蛋白表达及Akt/survivin信号通路,分析自噬与Akt/survivin信号通路间的关系。研究结果:mDPC6T细胞在受到LPS刺激的24h内细胞活力并无显著变化。western blot检测到自噬的标志分子LC3在6h和12h的LPS刺激组表达高于对照组,24h时却低于对照组。自噬其他相关蛋白p-ULK1S5’ Atg5-Atg12和上游分子p-AMPKaT172呈现出与LC3相似的表达趋势。LPS刺激组中这些自噬相关蛋白呈现出先上调再下降的趋势,且在6h达到峰值。凋亡相关指标cleaved caspase3表达随时间逐渐增加。LC3的免疫荧光结果发现红色荧光点在LPS处理组中明显高于对照组,统计学分析检测到LC3阳性细胞数目受到LPS刺激后显著增多。使用CQ阻断自噬过程后,6h时对照组、CQ处理组和LPS处理组细胞活性并无明显改变,CQ+LPS组细胞活力明显下降;然而12h时,使用CQ抑制自噬后,细胞的活力反而升高。western blot检测到survivin的蛋白水平也呈现出相似的表达。而p-Akt在6h并无明显变化,在12h的CQ组和CQ+LPS组中表达明显上调。这些都表明自噬在LPS刺激下的mDPC6T细胞中发挥着双重作用。最后在6h 使用 LY294002 抑制 Akt 后 survivin 无变化,在 12h 抑制 Akt 后,p-Akt、p-S6和survivin下调,LC3II/LC3I的比值增高。这些结果表明在12h增加的Akt和survivin可以减少细胞内所诱导的自噬性细胞死亡。结论:炎症刺激早期自噬是成牙本质细胞的重要生存机制,晚期过度的自噬会导致细胞死亡,此时Akt信号被激活抑制过度自噬,并上调细胞生存分子survivin,维持成牙本质细胞在炎症微环境中的稳态。第二部分自噬调节炎症环境中细胞成牙本质向分化能力研究目的:成牙本质细胞受到炎症刺激时会产生炎症和修复因子,并形成反应性牙本质来抵御侵袭。当刺激加重时,成牙本质细胞死亡,牙髓中的前体细胞分化为成牙本质样细胞,分泌修复性牙本质抵御病变进展。自噬是应激状态下的重要生存机制,在第一部分研究中发现其参与到成牙本质细胞抵御炎症的过程中。我们此部分探讨炎症环境中自噬是否参与牙髓前体细胞成牙本质向的分化过程及作用机制。研究方法:采用全培养基（Control）,矿化诱导液的培养基（MM）及矿化诱导液和脂多糖（LPS）共培养培养基（MM+LPS）分别培养前成牙本质细胞系（mDPC6T）。14天后进行茜素红染色,观察矿化结节的形成量,同时提取D0、D1、D3、D5和D7天的蛋白进行ALP活性检测和western blot检测。使用monodansylpentane（MDH）染色检测三组细胞中自噬体的形成。mRFP-GFP-LC3双荧光质粒转染细胞后在MM+LPS中培养0、6、12、18h,观察荧光的变化,分析胞内的自噬流变化。采用氯喹（CQ）阻断自噬,雷帕霉素（rapmycin）增强自噬,BAY 11-7082抑制NF-κ B激活后,检测自噬指标、分化相关指标和p-NF-κ B的变化,分析之间的关联性。分别观察自噬标志指标LC3和炎症信号分子p-NF-κB在MM+LPS培养的细胞中的表达,以及用Atg5 siRNA阻断自噬后二者在细胞内的分布情况。观察感染牙齿中成牙本质细胞及牙髓细胞中自噬和p-NF-κ B的表达。研究结果:茜素红染色结果显示在对照组几乎检测不到矿化结节的形成,MM组可观察到散在的矿化结节,而MM+LPS组可见矿化结节的量明显增多。ALP的活性在第7天MM+LPS组明显高于MM组。Western bolt结果显示在MM+LPS组中矿化指标DSP、DMP1及0SX随时间增长呈现升高趋势。自噬相关指标LC3、Atg5、Beclin1均逐渐上调,同时细胞内NF-κ B也被激活。MDH结果显示在MM组中有自噬泡的形成,LPS刺激后自噬泡形成明显增多。转染mRFP-GFP-LC3双荧光质粒后,可见自噬流不断增加。CQ抑制自噬之后矿化结节量减少,成牙本质细胞分化相关指标DSP、DMP1及0SX表达下调;rapamycin增强自噬后矿化结节量显著增多,且分化相关指标表达上调。BAY 11-7082阻断NF-κB激活后,分化相关指标表达也上升。自噬和p-NF-κB呈现负相关,抑制自噬后p-NF-κB表达增多,增强自噬后其表达减弱;且在Atg5siRNA阻断自噬后p-NF-κB的胞核转移量明显增多。同时在深龋牙齿标本中观察到成牙本质细胞和部分牙髓细胞中有p-NF-κ B和LC3的激活和二者的共定位。结论:炎症微环境中自噬通过抑制NF-κB的核转移抑制炎症,增强细胞成牙本质向的分化能力,形成修复性牙本质抵御炎症侵袭。