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光学纯的仲醇是一类重要的手性合成砌块,由于其具有活泼的羟基,故可以通过一些简单的修饰得到各类手性合成单元,作为重要的前体用于合成许多天然产物、农药、香精香料、材料、药物等。依鲁替尼(Ibrutinib)是一种靶向抗癌新药,抑制布鲁顿酪氨酸激酶活性,用于套细胞淋巴瘤的治疗。(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶是合成依鲁替尼关键手性中间体。本文首先将来自Thermoanaerobacter brockii的醇脱氢酶基因(ADH)与来自Bacillus subtilis的葡萄糖脱氢酶基因(GDH),分别连接到pRSFDuet-1质粒的两个克隆位点上,构建了重组表达菌株,其能够实现ADH和GDH在细胞内的共表达和胞内辅酶NADPH的再生。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,醇脱氢酶与葡萄糖脱氢酶在培养条件下均为可溶性表达,分子量分别为38和27 kDa,与文献报道的一致。其次,采用单因素优化的方法,从碳源、氮源、金属离子、诱导条件、初始pH、培养温度几个方面着手对重组工程菌的培养基与培养条件进行优化。最终优化的培养基成分为(g/L):可溶性淀粉30,酵母粉15,氯化钠5,初始pH调至6.0。优化的条件为:先在37~oC培养3 h后加入终浓度为0.025 mM的IPTG,继续在40~oC培养10 h。优化后,发酵液的酶活和细胞量分别为139.8 U/L和6.6 g/L,分别是优化之前的11倍和3.6倍。对等量的微生物细胞催化底物的不对称还原反应进行比较。优化后的培养基中培养的细胞催化反应时,50 mM的底物8小时的转化率达到95%。然而,在LB培养基中培养的细胞在同样条件下转化率仅为56%。最后,对所构建的工程菌整细胞催化合成手性药物中间体(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的反应条件进行优化。重点考察底物浓度、pH、助溶剂、葡萄糖含量、辅酶添加量等因素对目标反应的影响。优化的反应条件如下:在50~oC、pH为8.0的磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L)中,反应体系中添加1.5倍底物摩尔当量的葡萄糖作为辅底物,5%甲醇充当助溶剂,辅酶添加量为0.1 mM时,转化率较高。1 mL体系中,反应2 h时,50 mM底物转化率为97.8%。底物浓度为250 mM,并用稀释的氨水控制反应过程中pH恒定时,1 h转化率即为98.5%。进一步将底物浓度提高至500 mM,反应时间至3 h,转化率达到96.2%。