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[目的]雪旺细胞(Schwann Cells,SCs)为周围神经系统成髓鞘细胞,在周围神经再生中发挥着至关重要的作用。周围神经损伤后,SCs转变为激活态雪旺细胞(Activated Schwann Cells,ASCs),分泌多种生长因子,促进轴突生长,维持神经元存活,吞噬髓鞘并形成轴突生长管道。同时,SCs作为种子细胞在细胞移植修复神经损伤方面有着广泛的应用前景,然而其神经修复的具体机制尚不明确。本课题应用蛋白组学技术,针对周围神经损伤前后的SCs进行蛋白质组学分析,以进一步阐明SCs修复周围神经损伤的具体分子机制。[方法]取成年Wistar大鼠,结扎单侧坐骨神经,7天后,取结扎侧坐骨神经提取原代ASCs,同时取对侧坐骨神经进行原代正常态雪旺细胞(Normal Schwann Cells,NSCs)培养,Ⅱ型胶原酶纯化传代法传至第3代,S-100免疫荧光染色鉴定SCs纯度,分别提取ASCs及NSCs蛋白,通过串联质谱标签(Tandem Mass Tag,TMT)联合液相色谱-串联质谱(Liquid Chromatography-tandem Mass Mpectrometry,LC-MS/MS)技术,获取两种细胞差异表达蛋白,并以差异比值大于1.5倍及P值小于0.05为筛选标准,筛选出显著差异表达蛋白;把获得的显著差异表达蛋白,输入Blast2GoPro软件,行GO(Gene Ontology)分析、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析、蛋白质网路互作分析等生物信息学分析;选取数个最显著差异表达蛋白,通过Western Blot实验做蛋白表达分析,通过RT-PCR实验做相应蛋白的RNA相对表达量分析,从而验证本实验结果的正确性。[结果]1.雪旺细胞的纯化。经过5-7天原代培养后,原代SCs融合度达到80%以上;采用Ⅱ型胶原酶纯化传代法可以有效纯化SCs,第三代SCs S-100免疫荧光染色鉴定示两种细胞均未见阴性染色细胞;2.蛋白质组学分析。提取ASCs及NSCs蛋白后,TMT联合LC-MS/MS技术共获得31477个唯一肽段(Unique peptides),获得5574个蛋白质,其中包括4473个可量化蛋白质;最终获得122个显著差异表达蛋白,其中包括72个表达上调蛋白及50个表达下调蛋白;KEGG分析结果显示,差异表达蛋白主要富集在嘌呤代谢通路(Purine metabolism)、抗生素的生物合成通路(Biosynthesis of antibiotics)、氨基糖和核苷糖代谢通路(Amino sugar and nucleotide sugar),GO分析结果显示,差异表达蛋白主要富集在细胞分化(cell differentiation)、氮化物代谢(cellular nitrogen compound metabolic process)及应激反应(response to stress)等生物学过程,富集在质膜(plasma membrane)、胞质(cytosol)、胞外空间(extracellular space)等部位,富集功能为离子结合(ion binding)、酶结合(enzyme binding)及酶调活性(enzyme regulator activity)。GO-enzyme分析结果示差异表达蛋白中含有大量氧化还原酶(Oxidoreductases)及水解酶(hydrolases)。3.实验结果的验证。选择Alb、Spp1及Pten 3个蛋白行Western blot分析;结果显示,Alb及Pten相对灰度值,ASCs高于NSCs;Spp1相对灰度值,ASCs低于NSCs;P值分别为0.0018、0.0006及0.0363,按照P<0.05的水准,差异有统计学意义。选择PTEN、SPP1、COMP、ALB 4个基因行RT-PCR分析,结果显示,ASCs相比NSCs,PTEN、COMP、ALB的RNA相对表达量比值>1,而SPP1<1,P值分别为0.0070、0.0118、0.0004、0.0063,按照P<0.05的水准,差异有统计学意义。上述结果与蛋白质组学信息一致。[结论]1.Ⅱ型胶原酶可以有效纯化SCs,可通过差速分离法提高SCs纯化效率。2.ASCs和NSCs在蛋白质表达水平上有明显差异;差异蛋白主要集中在嘌呤代谢通路、抗生素生物合成及氨基糖和核苷糖代谢通路,提示PNS神经修复与这些生物过程相关;细胞分化及氮化物代谢过程可能在PNS神经损伤修复中发挥关键作用;PNS神经损伤修复过程中,包含大量酶的激活,其中以氧化还原酶及水解酶居多。