[研究背景]肝癌在全世界范围内发病率居第六位,死亡率居第三位。在中国,慢性乙型肝炎感染是肝癌的主要原因。乙型肝炎病毒携带者有1.2亿之众,约占我国人口的9%,慢性乙型肝炎和肝硬化患者有3000多万。慢性乙型肝炎患者中,10-20%可发展为肝硬化,1%-5%可演变为肝癌。肝癌的治疗手段主要包括手术切除、局部治疗和全身性化疗。对于早期肝癌,手术治疗和经皮射频消融(Percutaneous Ablation)可能完全治愈。而进展期肝癌,经动脉化学栓塞治疗(TransarterialChemombolisation,TACE)和索拉非尼(Sorafenib)化疗可延长患者生存期。其他治疗如单纯动脉栓塞和局部放疗具有一定的抗肿瘤疗效,但能否延长患者的生存期仍有待研究证实。索拉非尼是首个经FDA批准用于进展期肝癌的靶向治疗药物,由于其对于慢性乙型肝炎所致的肝癌疗效差,因此在我国,进展期肝癌亟待更好的靶向治疗药物。泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system, UPS)是介导细胞内蛋白质降解的主要途径之一,广泛影响着细胞增殖、分化、凋亡及应激应答等细胞生物学行为。UPS功能失调可促进肿瘤发生、发展和转移,因此UPS已经成为抗肿瘤药物开发的主要靶点之一。蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib)作为抗肿瘤新药,已经获得FDA批准应用于多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤的临床治疗,并取得显著疗效。然而,硼替佐米阻断整个UPS蛋白质降解,化疗不良反应大,因此需要靶向性更好的新药物。在UPS中,E3泛素连接酶决定底物蛋白的特异性,因而开发针对特定E3泛素连接酶的靶向抑制剂来阻断部分蛋白底物降解,而不影响其他蛋白的降解,将增加药物选择性和降低药物毒副作用,目前己成为UPS靶向治疗药物的主要研究方向。CRL (Cullin-RING Ligase) E3泛素连接酶(CRL泛素连接酶,CRL)是细胞内最大的多亚基泛素连接酶,由含有RING结构域的RBX蛋白(也称ROC),Cullin蛋白和F-box蛋白等亚基组成。CRL通过识别并降解底物蛋白,参与调控多种重要的生理过程,如细胞周期、基因转录、细胞凋亡、DNA复制,因此CRL调控失常可以导致各种疾病的发生,甚至肿瘤。目前已经发现多个CRL组成亚基是癌基因参与肝癌发生的发展,如RBX1、Cullin4A、SKP2、β-TrCP和Cullin4A。CRL作为多亚基泛素连接酶,其功能发挥除了需要其组成亚基有效组合外,还依赖Cullin蛋白的类泛素化Neddylation修饰,即将类泛素小分子NEDD8连接到Cullin上,进而改变CRL构象并使其激活,促进底物降解。Neddylation修饰过程中的关键酶是NEDD8活化酶(Neddylation Activation Enzyme, NAE)。2009年,Millenium公司开发了针对NAE的特异性小分子抑制剂MLN4924。前期研究表明,MLN4924通过抑制NAE,阻断Cullin蛋白Neddylation修饰进而灭活CRL,不仅具有显著肿瘤杀伤效果,而且具有高度的安全性。[研究目的]本研究致力于阐明MLN4924在体内外对肝癌细胞的杀伤作用,研究其杀伤作用机制。为临床试验中合理选择治疗应答分子指标、评价治疗效果、优化给药方案提供科学依据,促进以CRL连接酶为靶点的抗肿瘤新药的研发。[研究方法]1.采用全自动活细胞观测影像分析系统、细胞计数法研究MLN4924在体外对肝癌细胞Huh-7和Hep G2增殖的影响；2.采用克隆形成分析方法研究MLN4924对Huh-7和Hep G2细胞克隆形成能力的影响；3.采用PI染色流式细胞仪检测法研究MLN4924对Huh-7和Hep G2细胞的细胞周期及细胞凋亡的影响；4.通过Western Blot方法研究MLN4924诱导Huh-7和Hep G2细胞发生细胞周期改变的分子机制；研究MLN4924诱导肝癌细胞发生细胞凋亡的分子机制；5.通过细胞衰老相关β半乳糖苷酶染色方法检测MLN4924诱导Huh-7和HepG2细胞发生细胞衰老的作用；6.通过Western Blot方法研究MLN4924诱导Huh-7和Hep G2细胞发生细胞衰老的分子机制；7.应用Western Blot法、LC3-EGFP荧光检测法、吖啶橙染色法和透射电子显微镜技术检测MLN4924对肝癌细胞自噬的影响；8.通过Western Blot方法研究MLN4924诱导肝癌细胞发生自噬的分子机制；9.通过siRNA技术下调自噬相关蛋白Atg5和Beclin 1,阻断MLN4924诱导的细胞自噬应答,研究阻断自噬对细胞凋亡的影响；10.利用自噬功能缺失的MEF-Atg5-KO、MEF-Atg7-KO和自噬功能正常的MEF-Atg5-WT、MEF-Atg7-WT细胞研究MLN4924诱导的自噬应答对MLN4924诱导细胞凋亡的影响；11.使用Hep G2-GFP细胞建立裸鼠的原位荧光肝癌模型。应用小动物荧光成像系统,实时动态观测MLN4924的体内抗肝癌效果,并观察MLN4924在肝癌治疗过程中的毒副作用；12.提取裸鼠肿瘤组织蛋白,用Western Blot法研究MLN4924的体内抗肝癌机制。[研究结果]第一部分：MLN4924灭活CRL泛素连接酶,诱导肿瘤细胞发生细胞周期阻滞、细胞凋亡和细胞衰老等表型杀伤肝癌细胞。MLN4924低剂量(0.1μmol/L)可显著抑制Cullin蛋白的neddylation修饰,灭活CRL功能,导致CRL底物如p21,p27发生积聚。MLN4924可以显著抑制Huh-7和Hep G2细胞增殖,显著抑制细胞克隆形成。MLN4924处理Huh-7和Hep G2细胞24小时,PI染色检测周期,结果显示G2／M期细胞显著增多,结合Western Blot发现组蛋白(Histone)H3磷酸化水平显著降低的结果,提示MLN4924诱导肝癌细胞发生G2期周期阻滞。机制上,MLN4924灭活CRL,导致底物蛋白Weel发生积聚,后者抑制Cdc2功能,导致G2期细胞不能进入M期(有丝分裂期)。MLN4924持续作用48小时,诱导Huh-7和Hep G2细胞发生DNA损伤应答(H2A和CHK2磷酸化水平增高)和细胞凋亡,而且凋亡细胞随着作用时间的延长逐渐增多。MLN4924持续作用72小时,Huh-7和Hep G2细胞发生形态学改变——变大而扁平,细胞衰老相关β半乳糖苷酶染色出现阳性,提示MLN4924诱导肝癌细胞发生细胞衰老。检测调控细胞衰老的两条最经典途径(p53/p21途径和p16/pRB途径),结果发现p21在两细胞中都发生积聚,提示MLN4924诱导肝癌细胞发生p21依赖性细胞衰老。第二部分：MLN4924诱导肝癌细胞发生保护性自噬,阻断自噬显著增加细胞凋亡,增强其抗肿瘤效果。研究发现,MLN4924不仅诱导Huh-7和Hep G2细胞发生细胞凋亡、细胞衰老杀伤肝癌细胞,且诱导发生细胞自噬：1)Western Blot结果显示细胞内自噬相关蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化增多；2) Huh-7-LC3-EGFP和Hep G2-LC3-EGFP细胞经MLN4924处理后,细胞内LC3-EGFP蛋白从弥散均匀分布变为点状、颗粒状不均匀分布；3)吖啶橙染色流式分析结果显示,Huh-7和Hep G2染色阳性细胞明显增多；4)使用自噬诊断的金标准——透射电子显微镜检测,结果发现MLN4924处理72h后,可观察到细胞内出现包绕线粒体或细胞质双层膜结构的自噬小体。机制上,我们发现MLN4924灭活CRL后,Huh-7和Hep G2细胞内CRL底物蛋白Deptor水平显著升高。Deptor蛋白升高抑制了mTOR信号通路,表现为磷酸化4E-BP1 (mTOR底物)水平显著下降,非磷酸化的4E-BP1水平显著升高。在Huh-7和Hep G2细胞中应用siRNA技术介导的Deptor蛋白下调,减轻了MLN4924对mTOR信号通路的抑制,抑制了MLN4924所致的细胞自噬。表现为下调Deptor蛋白,恢复MLN4924所致的磷酸化4E-BP1水平下调,下调MLN4924所致的非磷酸化4E-BP1水平升高,减少MLN4924所致的LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化。该结果提示Deptor是MLN4924诱导细胞自噬过程中的一个重要蛋白。MLN4924处理Huh-7-LC3-EGFP和Hep G2-LC3-EGFP细胞,结果发现24小时诱导LC3-EGFP蛋白发生点状、颗粒状不均匀分布,而48小时诱导细胞周期Sub-G1增多,提示MLN4924在肝癌细胞中诱导的细胞自噬的发生早于细胞凋亡。利用siRNA技术在Hep G2细胞中下调自噬相关蛋白Atg5和Beclin 1水平,部分阻断MLN4924所致的细胞自噬应答,增强了MLN4924所致的Caspase3活化(从13.3%增加到21.9%)。与MEF-Atg5-WT(自噬功能正常)细胞相比,不同浓度的MLN4924诱导MEF-Atg5-KO(自噬功能缺失)细胞发生更加显著的细胞凋亡。相似的结果在MEF-Atg7-KO(自噬功能缺失)和MEF-Atg7-WT细胞中得到验证。该结果提示阻断MLN4924诱导的细胞自噬应答可促进其诱导的细胞凋亡。第三部分：MLN4924在小鼠体内诱导肿瘤细胞发生细胞凋亡和细胞自噬,显著抑制原位肿瘤增殖,并且具有良好的耐受性。在Hep G2-GFP裸鼠原位荧光肝癌模型中,MLN4924显著抑制了肿瘤增殖的速度。荧光成像系统实时观察显示,MLN4924治疗组肿瘤组织的平均荧光面积从21天开始显著低于对照组。治疗结束后,MLN4924治疗组平均瘤重为0.51g,显著低于对照组的平均瘤重1.25g。抽提肿瘤组织蛋白用于Western Blot检测,结果显示在体内MLN4924同样灭活CRL,导致底物蛋白p21和p27积聚：诱导CRL底物Deptor发生显著积聚,促进自噬发生；MLN4924提高CHK2磷酸化水平,促进PARP和Caspase-3活化,提示诱导DNA损伤应答和细胞凋亡。不良反应研究结果显示：MLN4924治疗组和对照组均未见动物死亡,治疗过程两组动物平均体重无显著差异。MLN4924治疗组可见3只小鼠的给药部位出现皮肤坏死,停止原部位注射后,坏死皮肤结痂。血清生化指标结果显示,两组动物肝功能(谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)),肾功能(肌酐(CREA)、尿素氮(BUN)),血清白蛋白(ALB)和肌酸激酶(CK)水平均无显著差异。[结论]1.研究发现CRL泛素连接酶靶向新药MLN4924显著抑制肝癌细胞增殖。其主要机制是MLN4924灭活CRL泛素连接酶,导致肝癌细胞内CRL底物蛋白Weel,p-H2A,p-CHK2,p21等发生积聚,诱导肝癌细胞发生细胞周期阻滞、细胞凋亡及细胞衰老等多种肿瘤杀伤表型。2.首次发现MLN4924可以诱导肿瘤细胞发生保护性自噬。其主要机制是MLN4924灭活CRL泛素连接酶,导致底物蛋白Deptor发生积聚,后者通过抑制mTOR信号通路,诱导肝癌细胞发生自噬发生。通过siRNA下调MLN4924所致的细胞自噬,可增强MLN4924的抗肿瘤效果。3.MLN4924显著抑制小鼠原位肝癌的增殖且具有良好的安全性。在荧光原位肝癌模型中,MLN4924通过诱导细胞凋亡和细胞自噬抑制原位肝癌增殖,具有显著的体内抗肝癌疗效和良好的耐受性。