研究背景4.1蛋白(由红细胞膜蛋白经SDS-PAGE后其所处的位置而命名的)是红细胞中以血影蛋白(spectrin)为基础的细胞膜骨架的一个基本成分，它与血影蛋白和肌动蛋白连接，在维持细胞正常形态和生物物理特性方面，并在细胞的有丝分裂的调控过程中起到重要作用。蛋白4.1基因的缺失会导致红细胞畸形和溶血。蛋白4.1家族包括4.1R(红细胞中表达)、4.1N(神经元特异表达)、4.1G(广泛表达)和4.1B(主要在脑中表达)，它们都具有一些相同的结构域：SABD结构域(spectrin-actin-binding domain)；FERM结构域(4.1-ezrin-radixin-moesin结构域)或称膜结合结构域(membrane binding domain，MBD)和CTD结构域(C-terminal domain)。胃癌是严重威胁人类健康的消化道恶性肿瘤。在我国，根据卫生部统计资料，90年代初恶性肿瘤死亡率排名第一位即为胃癌。深入研究胃癌的发病机制以及早期诊断、预后评估的方法具有十分重要的临床和社会价值。研究发现，在脑膜瘤、室管膜瘤、非小细胞肺癌和乳腺癌等多种肿瘤中，4.1蛋白的表达缺失，并且越来越多的临床和实验证据证实编码4.1蛋白的基因家族成员在多种肿瘤中表现出抑癌基因的作用。迄今为止，关于4.1蛋白家族成员与胃癌发病的相关性的研究尚未见报道。考虑到4.1蛋白家族成员间的分子结构具有很高的同源性，其成员间在功能上可能也具有相似性，本研究对4.1蛋白家族不同成员在胃癌组织中表达情况及其与胃癌发病机理的相关性进行了深入的研究。免疫组织化学技术是一种在组织或细胞原位研究基因产物的常用技术，在形态学领域已得到了广泛应用，随着免疫组化技术的发展，涌现出一批新的免疫组化方法如SP，ABC，SABC和Envision~+法等，有研究发现，Envision~+法较其他几种的敏感性高，而且可以减少组织染色中的过显及非特异性染色。Envision~+法是在多聚物上连接二抗和酶，在人体组织中不含有这种多聚物，从而避免了人体组织中生物素的干扰，得到较为理想的染色效果，所以，本实验采用了Envision~+法来检测4.1蛋白家族成员在胃癌组织中的表达情况。实验目的1．应用Envision~+免疫组织化学的方法检测104例胃癌及68例癌旁正常组织中4.1蛋白家族成员(4.1B、4.1R、4.1G和4.1N)的表达情况，分析其表达情况与临床病理之间的相关关系并探讨4.1蛋白家族成员的表达与胃癌发生、发展的关系，以期为胃癌诊断、治疗和判断预后提供依据。2．筛选4.1蛋白表达缺失的细胞系，为研究4.1蛋白的抑癌功能提供材料。实验方法1胃癌组织的免疫组织化学1．1实验标本的获取、分类、切片收集2005年1月-2006年6月间郑州大学第二附属医院病理科胃癌手术标本蜡块共104例，其中男77例、女27例，中位年龄61.7(35-88)岁。每例均有详细的临床资料和手术记录。所有病例术前均未进行任何放疗、化疗和免疫治疗。伴有淋巴结转移者共51例。参照1981年WHO推荐的分化分级标准：高分化腺癌30例，中分化腺癌28例，低分化腺癌46例。同时取104例病例中的68例符合对照标准的癌远切端胃粘膜组织作为对照组。标本均经4％缓冲甲醛溶液固定，梯度酒精脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋。实验前将蜡块切片至3-4μm／片。1．2常规HE(苏木素—伊红)染色采用常规HE染色(苏木素—伊红染色)方法，在拥有原医院病理资料的前提下，进一步明确实验标本的病理学特征。1．3实验标本的Envision~+免疫组织化学染色同时检测实验组和对照组标本中4.1B、4.1R、4.1G、4.1N的表达情况，具体步骤在65℃烤片3小时，逐级脱蜡、水化后按照Dako公司的Envision~+免疫组化试剂盒说明书进行。注：不同一抗对应的抗原修复方式不同，4.1NHP用的是高pH值抗原修复液，热修复20min；4.1BU2用的是低pH值抗原修复液，热修复20min；4.1RE13用的是高pH值抗原修复液，热修复20min；4.1GU3用的是蛋白酶修复，室温5min。4.1N、4.1B、4.1G和4.1R均选用癌组织内的血管作为阳性对照；用PBS代替一抗作阴性对照。1．4免疫组织化学结果的测定免疫组化染色阳性结果为胞膜或胞浆内出现棕褐色颗粒或棕褐色染色。每张切片均分别由两位病理科医生进行盲读。结果判定按半定量评分标准进行，具体如下：在高倍镜下，无着色记为0分，浅褐色记为1分，褐色为2分，深褐色为3分。同一张组织切片，由于分化程度差异，染色也存在差异，此种情况以主导染色计分；阳性细胞百分率≤10％记为0分，10％-50％记为1分，50％-75％记为2分，75％以上记为3分。两者相加为综合染色强度评分。0-1分为“-”，2分为弱阳性“+”，3-4分为阳性“++”，5-6分为强阳性“+++”。1．5实验结果的分析采用SAS 9.13分析软件包行统计学处理。应用卡方检验分析4.1B、4.1R、4.1G和4.1N表达与临床病理的关系。2 4.1蛋白表达缺失细胞系的筛选培养肿瘤细胞系EC109、EC9706、ECl，用免疫细胞化学和Western blot鉴定4.1蛋白在细胞系中的表达情况。结果1．常规HE染色结果均证实了临床诊断所判定的病理及分化类型。2．胃癌及相应癌旁对照组织4.1B、4.1R、4.1G和4.1N的表达情况：4.1B、4.1R、4.1G和4.1N在胃癌组织中的表达程度明显低于癌旁对照组(均P＜0.01)。3．4.1B、4.1R、4.1G和4.1N的表达与组织分化的关系：4.1B、4.1G和4.1N的表达程度随着癌组织分化的降低而减弱(P_B＜0.05，P_G、P_N＜0.01)，4.1R的表达程度有随着癌组织分化程度降低而减弱的趋势，但是差异无统计学意义(P_R＞0.05)。4．4.1B、4.1R、4.1G和4.1N的表达与淋巴结转移的关系：4.1B和4.1N的表达程度在伴有淋巴结转移的病例和未伴有淋巴结转移的病例中的差异有统计学意义(P_B＜0.05，P_N＜0.01)。4.1R和4.1N的表达程度在伴有淋巴结转移的病例和未伴有淋巴结转移的病例中的差异无统计学意义(均P＞0.05)。5．4.1B、4.1R、4.1G和4.1N的表达与浸润深度的关系：由于浸润深度仅限于粘膜层的病例过少，4.1B、4.1R、4.1G和4.1N的表达程度在不同浸润深度的病例中的差异无统计学意义(均P＞0.05)。6．EC9706、EC109、EC1肿瘤细胞系均表达4.1蛋白。结论1．4.1B、4.1R、4.1G和4.1N在胃癌组织中的表达程度明显低于癌旁对照组，提示4.1B、4.1R、4.1G和4.1N与胃癌的发生、发展密切相关。2．4.1B、4.1G和4.1N的表达程度和胃癌组织分化程度明显相关，4.1R的表达程度和癌组织的分化程度无明显相关，提示4.1B、4.1G和4.1N的表达异常可能与肿瘤的恶性程度有关。3．4.1B和4.1N与胃癌淋巴结转移相关，4.1G和4.1R与胃癌淋巴结转移无明显相关，提示4.1B和4.1N的表达异常可能参与胃癌淋巴结的转移过程。4．4.1R的表达程度在胃癌组织和癌旁组织中差异明显，但是与癌组织的分化程度、是否伴有淋巴结转移无明显相关性，提示4.1R蛋白的表达异常可能是胃癌发生、发展的早期事件。5．EC9706、EC109、EC1肿瘤细胞系均表达4.1蛋白，不适合作为通过导入4.1蛋白而研究4.1蛋白抑癌作用的材料。