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第一部分房水对培养角膜内皮细胞的作用目的：通过培养B-CEC，观察培养液中添加不同体积分数的房水对培养的B-CEC的影响，为在体外建立接近生理的微环境条件下培养角膜内皮细胞提供新思路和新方法。方法：从新鲜牛眼球前房抽取1.2ml房水，经离心过滤后取上清备用。从牛眼角膜组织分离牛角膜内皮细胞(corneal endothelial cells, CEC)并在含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM培养液中进行培养传代。分别在培养液中加入不同体积的房水，使房水终体积分数分别为2.5%、5.0%、10.0%、15.0%、20.0%，对照组不加房水，利用CCK-8比色法检测各组细胞在450nm处的吸光度（A450）值。流式细胞仪分析10.0%房水培养对CEC细胞周期的影响。待培养细胞融合成单层后，1ml塑料移液器尖端在培养皿底划痕并用含10%FBS的培养液中加入10.0%房水培养24h，未加入房水的培养液作为对照组，检测细胞单层的愈合情况。将细胞以6×105个/ml密度接种到培养皿中，分别用含10.0%房水的培养液和无房水的培养液孵育5d，利用DAPI荧光染色技术分析细胞密度。结果：培养的CEC呈六角形、铺路石样的扁平状。CCK-8比色法检测表明，各培养组细胞的A450值总体比较差异有统计学意义(F=4.051, P=0.007)；与对照组比较，各房水培养组细胞的A450值均明显高于对照组，以含10.0%房水培养组CEC的A450值最高，差异有统计学意义（P<0.01）。流式细胞术分析表明，10.0%房水孵育24h后，处于S-G2期的细胞比例为（34.80±3.13）%，对照组为(23.06±1.13)%，差异有统计学意义（t=-5.729, P=0.005）。划痕愈合分析检测表明，10.0%房水组的细胞单层划痕面积为(0.116±0.019) mm2，对照组为(0.358±0.049) mm2，差异有统计学意义（t=13.842, P=0.000）。DAPI荧光染色结果显示，10.0%房水组的平均细胞密度为（1439±110）个/视野，大于对照组的（1162±45）个/视野，差异有统计学意义（t=-11.020, P=0.000）。结论：房水作用于培养的牛CEC后可促进CEC的生长，10.0%房水对培养的CEC有促进角膜细胞增生的作用。第二部分Y-27632对培养角膜内皮细胞的作用目的：观察ROCK激酶特异性抑制剂Y-27632对体外培养的B-CEC的影响。方法：从带有角膜内皮细胞的组织块中分离原代的B-CEC。内皮细胞培养在1%的血清培养基中，以检测Y-27632对角膜内皮细胞增生的影响。流式细胞术检测Y-27632对细胞的周期和凋亡的影响。用荧光显微镜观察AnnexinV-FITC和PI染色凋亡细胞情况。相差显微镜观察Y-27632对B-CEC形态的影响。免疫荧光分析B-CEC的培养液添加Y-27632后，β-actin、AQP1和Na+/K+-ATPase的表达。培养液添加Y-27632后，B-CEC的贴壁和细胞间的粘附能力也被检测分析。划痕实验和悬滴培养用来分析添加Y-27632后B-CEC的迁移能力的变化。结果：10μM Y-27632能够适度的促进B-CEC的增生。Y-27632能够诱导体外培养的B-CEC形态的改变，撤出Y-27632后细胞形态可以恢复正常。Y-27632对B-CEC的特异性标志物的表达没有影响。早期贴壁实验、胰酶消化实验和划痕实验说明Y-27632可以显著的增加细胞的粘附和迁移能力。悬滴培养B-CEC发现Y-27632可以促进细胞在气液的界面形成网络状和片状生长，也可以促进细胞迁移到培养皿的表面。结论：Y-27632可以作为培养基的添加物促进培养的B-CEC的增生、粘附和迁移。Y-27632将有利于CEC的细胞移植治疗和局部应用治疗CEC缺陷。第三部分生物模拟促进iPS分化为CEC目的：探索利用生物模拟角膜的发育特征和体内微环境的多种条件，促进诱导多能干细胞(iPS)分化为角膜内皮细胞的方法，为获得iPS细胞来源的角膜内皮细胞(CEC)提供新的途径。方法：通过相差显微镜观察iPS细胞的生长状态及形态特性。iPS细胞分化为角膜内皮细胞方法如下：方案一，进行iPS细胞与牛角膜内皮细胞共培养，在相差显微镜和扫描电镜下观察细胞的形态变化。方案二，通过模拟角膜的发育特征和体内微环境，利用GSK-3β抑制剂VI、维甲酸(RA)、TGF-β2、b-FGF、房水、牛角膜内皮细胞外基质(B-ECM)和共培养技术促进iPS细胞分化为角膜内皮细胞。通过免疫荧光染色观察分化过程中iPS细胞的标志物SSEA4、Oct4、TRA-1-60(S)和SOX2的表达，以及神经干细胞标志物Nestin，角膜内皮细胞的标志物ZO-1、N-Cadherin、Na+K+-ATPase和AQP1的表达情况。结果：经方案一诱导分化后，iPS细胞大多数表现出分化状态。SEM显示B-ECM呈细丝状纤维排列在一个相对平整的表面形成粗糙的结构。GSK-3β抑制剂VI和RA在角膜内皮细胞的分化诱导中是关键的因素，可以促进iPS细胞分化为神经类的干细胞。经上述方案二分化诱导后，起源于iPS细胞的角膜内皮样细胞表现出多角形态，表达神经干细胞标志Nestin。房水、TGF-β2和B-ECM可以促进起源于iPS细胞的角膜内皮样细胞的成熟。这种细胞经过成熟分化后，部分细胞的表达角膜内皮细胞的标志物N-Cadherin, ZO-1和Na+K+-ATPase。结论：GSK-3β抑制剂VI、RA、TGF-β2、b-FGF和房水，以及与B-ECM和CEC细胞共培养，可以诱导iPS细胞分化为角膜内皮细胞样的细胞。细胞所处的整个微环境对iPS细胞分化十分重要，来自模拟角膜内皮细胞发育特征和角膜体内微环境的生物模仿的各种条件，可以促进iPS细胞分化为角膜内皮样细胞。本研究为获得iPS细胞来源的角膜内皮细胞提供了新的途径。