论文部分内容阅读
坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)感染是危害养鸭业的新发传染病,对于我国养鸭业具有重要的经济意义。迄今为止,TMUV的分子致病机制尚不清楚。本研究以毒力存在差异的TMUV分离株为材料,对决定毒株间毒力差异的关键基因和位点进行分析和鉴定,以期为阐明TMUV的分子致病机制提供数据。2014年10月,两个3～4周龄麻鸭群发生了一种以瘫痪为特征的疾病。经RT-PCR检测、病毒分离、间接免疫荧光检测和动物试验,确定致病病原为TMUV。将第3代鸭胚分离株(GL株)经脑内途径接种2日龄北京鸭,可复制出与自然病例相似的症状,在接种后3～6d雏鸭死亡率达100%。结果表明,该TMUV分离株对北京鸭雏鸭具有高致病性。为观察TMUV不同毒株的毒力差异,以2日龄北京鸭为动物模型,用PS株、Y株和GL株经脑内途径进行感染试验。结果显示,感染Y株和GL株后,雏鸭表现出严重的临床症状和组织病理变化,且死亡率分别为80%和70%。而PS株未导致雏鸭死亡,仅影响雏鸭增重,所引起的组织病理学变化也较轻微。由此可见,Y株和GL株对雏鸭的毒力显著高于PS株。基因组测序和序列比较结果显示,在非编码区,PS株分别与Y株和GL株存在3个和4个碱基差异;在聚蛋白氨基酸水平,PS株分别与Y株和GL株存在16个和19个氨基酸差异,结果提示,这些差异位点可能是决定毒株间毒力差异的分子基础。为鉴定TMUV毒力相关基因和位点,构建了PS株的反向遗传操作技术平台。用RT-PCR对PS株基因组进行了分段扩增,获得5个(称为A、B、C、D和E)基因片段,并由此构建重组质粒pBR322-AB和pBR322-BCDE。以这两个质粒为模板进行PCR扩增,并利用融合PCR方法获得PS株的全长cDNA。经体外转录,用纯化后的RNA转染BHK-21细胞,成功拯救出病毒。比较结果显示,拯救病毒在BHK-21细胞上的生长特性以及对小鼠的致病性均与亲本病毒相似,除遗传标记外,拯救病毒与亲本病毒序列一致。在上述工作基础上,以PS株基因组为骨架,分别构建了含Y株不同基因区(5’UTR、3’UTR、E 和 NS1-3’UTR)的嵌合毒株(rPSY5’UTR、rPSY3UTR、rPSYE和 rPSYNS1-3’UTR)。致病性试验结果显示,嵌合病毒rPSYE可使70%的雏鸭死亡,与Y株的毒力相近,由此可见,用Y株的E基因替换PS株的E基因,可显著提高PS株对雏鸭的致病性,提示E基因是决定TMUV PS株和Y株毒力差异的关键基因。运用定点突变技术,将PS株E蛋白304位精氨酸(R)突变为Y株E蛋白对应位置上的蛋氨酸(M),构建了突变病毒 rPSYER304M。致病性试验结果显示,用 rPSYER304M感染2日龄北京鸭,可引起60%的死亡率,与Y株所致死亡率相似,而亲本拯救毒株rPS感染雏鸭的死亡率仅为10%。结果表明,E蛋白304位氨基酸(R/M)是决定TMUV PS株和Y株毒力差异的关键位点。