辣椒疫霉(Phytophthora capsici)是一类重要的病原卵菌,其寄主广泛,能够侵染茄科(辣椒,番茄)、豆科(利马豆,豆角)和大部分瓜类等植物并能造成毁灭性的灾害。现阶段,针对该病害的防治还缺乏有效的措施,由于辣椒疫霉菌容易变异且病害流行蔓延速度快,生产上使用的一些杀菌剂往往达不到很好的效果。那么,从辣椒疫霉的致病机理入手,寻找有效的作用靶标对该防治病害至关重要。辣椒疫霉为半活体营养菌,在活体营养阶段会分泌一系列效应因子来调控植物的免疫防卫反应从而促进其侵染定殖。在种类多样的外泌蛋白物中,一类与致病性相关的细胞质效应因子被发现。该类效应因子的N端具有RxLR-dEER基序和信号肽结构域,起着分泌和靶定寄主细胞内蛋白的功能,而其C端是功能活性区,有调控寄主防卫反应的作用。明确此类效应因子的功能和作用机制有利于揭示疫霉菌致病的分子机制,并为进一步利用抗病基因工程方法开发疫霉病害的防控策略提供科学依据。我们通过辣椒疫霉侵染阶段的转录组测序、生物信息学分析预测以及农杆菌介导的瞬时表达系统等对效应因子的功能进行分析,筛选得到了一个能够引起烟草细胞死亡的细胞质效应因子PcRxLR207和一个能够促进辣椒疫霉侵染的细胞质效应因子PcRxLR103,并对这两个效应因子展开作用机制的研究,结果如下:PcRxLR207具有诱导细胞死亡活性,其靶标蛋白为RBPs:通过对多个辣椒疫霉效应因子进行功能鉴定,我们发现PcRxLR207能够在烟草上引起细胞死亡。为明确其在植物体内的作用位点,我们通过亚细胞定位实验发现PcRxLR207仅分布在细胞质中。为了深入了解PcRxLR207的作用机理,我们利用酵母双杂交系统去钓取拟南芥基因cDNA文库,得到了可能与PcRxLR207互作的靶标基因BPA11、RRMP1、RRMP2和RRMP3。经NCBI数据库比对及生物信息学预测分析,靶标基因均具有保守的RNA-bindingmotif,均可能表达RNA-bindingproteins(RBPs)。在此基础上我们通过两种公认的互作验证系统酵母双杂交(Y2H)和双分子荧光互补(BiFC)验证得到PcRxLR207能够与RBPs直接互作,并且互作位点在细胞质中。另外,对RBPs进行亚细胞定位发现,RBPs在细胞核和细胞质中都有分布。通过以上实验,我们发现两蛋白单独定位和相互作用后的位点的转移,推测PcRxLR207可能通过改变RBPs的定位来降低其活性从而导致植物生长异常,促进辣椒疫霉的侵染。PcRxLR103能够促进辣椒疫霉的侵染,并在侵染初期和后期发挥着重要作用:本章从辣椒疫霉菌中成功克隆了多个RxLR效应因子,并将其构建到病毒表达载体PVX。利用农杆菌介导的植物瞬时表达系统,在本氏烟叶片中分别瞬时表达这几个效应因子后再接种辣椒疫霉菌,获得了一个能够显著促进疫霉菌侵染的效应因子PcRxLR103。实时定量PCR分析结果表明PcRxLR103在侵染阶段上调表达,表明其在侵染过程中可能发挥重要作用。细胞死亡诱导实验结果显示PcRxLR103可以诱导微弱的植物细胞死亡,然而该细胞死亡诱导活性与促进病原菌侵染的毒性功能之间的关系尚不明确,推测其可能通过抑制植物的防卫反应来促进病原菌的侵染。为明确其作用机理,一方面我们通过花序浸染方法和FAST技术,将PcRxLR103转化进入拟南芥植物中并通过荧光显微镜筛选得到可以激发绿色荧光的转基因种子TO代。同样,通过种植,收获,筛选等步骤,可培育至T3代,获得稳定遗传植株。利用转有PcRxLR103基因的拟南芥植株,可以开展基因功能、信号通路等的研究。另一方面我们通过酵母双杂交和双分子荧光互补技术筛选并验证PcRxLR103在植物体内的靶标基因,了解其作用机理,从而推动辣椒疫霉菌致病机理的研究进程。