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目的:抗生素的应用和细菌耐药性的产生是共同发展的,而细菌的耐药机制中以β-内酰胺酶的产生为最主要原因。而近年来随着第三、四代β-内酰胺类抗生素和酶抑制剂克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦等的联用,细菌面临双重选择压力,β-内酰胺酶发生了进化突变,酶的生物学结构改变,在酶活性位点上的结构变化使得酶能水解新的β-内酰胺类抗生素,产生了超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrumβ-lactamases,ESBLs)。ESBLs主要由大肠埃希菌和克鲁伯属细菌产生,大多数由TEM-1、TEM-2、SHV-1在104、164、238和240位点发生一个或多个氨基酸突变而形成,酶活性部位的空间结构发生改变,扩大了水解底物范围,从而增加了对氧亚氨基类抗生素的亲和力和水解能力。ESBLs目前已发现至少387种基因型:TEM型155种、SHV型91种、OXA型88种、CTX型53种,而且新的种类还在不断的发展和发现中。不同基因型的来源不同,分布不同,分子构型也有较大区别,因此其耐药性也有不同特性。CTX-M型是主要的非TEM/SHV型ESBLs,其特点是对头孢噻肟(CTX)水解活性高,对头孢他啶水解活性低。1990年德国的Bauernfeind等首次报道后迄今已发现30余种,主要由大肠埃希菌、鼠伤寒沙门菌、变形杆菌、产气肠杆菌等细菌产生,各亚型之间结构基因编码区核苷酸序列差异较大,同源性介于71%-99%,pI 7.5～8.9。CTX-M型ESBLs主要流行于欧洲、南美洲、中东、远东和中国等地区,国内关于ESBLs鉴定到型别的报告在近几年内有所增多,研究表明我国主要的ESBLs类型为CTX-M型。但国内对于CTX-M型ESBLs的研究还不够深入,多数仅限于本地区流行亚型及其耐药性的总结,不能有效地发现其耐药特点,从而无法指导临床用药。本研究采用PCR方法,有目的地扩增CTX-M型基因片段,经转化、质粒提取、测序、表达蛋白等步骤,为进一步深入研究其耐药特点、指导临床用药从而降低耐药性的发生奠定了试验基础。材料与方法:自2006年7月到2007年7月收集临床分离大肠埃希氏菌标本和克鲁伯菌,均来自郑州大学第一附属医院,经双纸片协同试验初筛、E-test确证,ESBLs阳性菌为27株,提取阳性菌混合物的质粒DNA,采用聚合酶链反应(PCR),用CTX-M-1、CTX-M-14、CTX-M-25、CTX-M-31四对引物扩增CTX-M部分亚型,经琼脂糖凝胶电泳观察结果后,胶回收目的片段,用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,连接pET28(a+)载体,构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL-21感受态细胞,提取重组质粒并测序,分析其碱基序列,证实其为目的基因片段,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达蛋白。结果:对27株ESBLs阳性的大肠埃希氏菌标本和克鲁伯菌混合培养物提取质粒,使用CTX-M亚型的四对引物扩增基因片段,CTX-M-1扩增结果阳性,其余为阴性,阳性片段在Marker907bp处;PCR产物经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,连接pET28(a+)载体,并经大肠杆菌BL-21感受态细胞转化后,提取CTX-M-1-BL-21质粒用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,重组质粒经测序为907bp,与电泳结果吻合,并与GeneBank中CTX-M-1基因同源性为100%。结论:郑州市流行的ESBLs基因型为CTX-M型,以CTX-M-1型最常见。在IPTG浓度为0.2mol/L时,CTX-M-1蛋白表达量最高。