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在畜牧业中,大肠杆菌是一种常见的且发病率较高的病原菌之一,它也可以引起畜禽及人的泌尿系统、呼吸系统等的感染。随着近年来抗生素的滥用,大肠杆菌对常用抗菌药物的耐药性已经达到了一个十分严重的趋势,主动外排系统是其主要耐药机制之一。外排泵抑制剂能够恢复常见抗生素的抗菌活性,使菌株对其耐药率降低。前期研究表明,黄芩苷能够增敏环丙沙星,是一种潜在的外排泵抑制剂。本试验目的在于研究黄芩苷增敏环丙沙星的主要外排基因,为挖掘老药潜力,克服单药耐药性,为环丙沙星更好应用于兽医临床奠定基础。为探讨黄芩苷与环丙沙星联用后的效应,本试验采用微量肉汤稀释法,测定了295株动物源大肠杆菌对四种喹诺酮类药物的耐药性,结果发现,分离菌株对四种药物的耐药率介于61.7%~72.2%之间,对环丙沙星耐药率最高,其中环丙沙星MIC≥64μg/mL的菌株8株。进一步测定了黄芩苷单药对以上8株耐药菌株的MIC值,结果2株黄芩苷MIC为512μg/mL,6株MIC为1024μg/mL;棋盘法测定了环丙沙星和黄芩苷联合的FIC,结果8株菌株FIC等于0.375,均为协同效应。使用16、32、64、128、256μg/mL黄芩苷进一步和环丙沙星联合,结果发现32μg/mL黄芩苷能够显著降低环丙沙星对耐药菌株的MIC,因此确定了黄芩苷与环丙沙星联用时最适宜的浓度为32μg/mL。为进一步测定探究黄芩苷对耐药大肠杆菌主动外排调控基因的mRNA表达水平的影响,对上述8株耐药菌株采取以下5种方式处理进行培养(1)不加任何药物(2)单独加32μg/mL黄芩苷(3)单独加4μg/mL环丙沙星(4)32μg/mL黄芩苷和4μg/mL环丙沙星联合(5)16μg/mL CCCP和4μg/mL环丙沙星联合,抽提总RNA并反转录cDNA,荧光定量PCR,测定主动外排调控基因及管家基因gapA的Ct值,并计算不同培养条件下各个耐药大肠杆菌基因acrA、acrD、marA、acrE、acrF、acrB、mdtA、robA、soxS的mRNA相对表达量的差异。结果表明,黄芩苷和环丙沙星联用与单独加入环丙沙星相比,acrE、acrB、acrF、mdtA、robA、soxS基因表达量变化不明显;acrA、acrD、marA基因表达量有明显的下降趋势,提示这3个基因是黄芩苷的作用靶点。为探讨反义寡核苷酸沉默acrA、marA、acrD基因前后,黄芩苷对临床耐药大肠杆菌环丙沙星敏感性的影响,设计以上3个基因的反义寡核苷酸引物,设置空白对照组、黄芩苷组、反义寡核苷酸沉默组、反义寡核苷酸沉默+黄芩苷组进行实验,分别转染到临床耐药菌感受态细胞中,涂布于一定浓度环丙沙星平板上,培养观察菌落生长情况并计数。结果发现,acrA、marA上述两个基因被沉默后,加入黄芩苷对环丙沙星的敏感性影响不明显;acrD基因被沉默后,加入黄芩苷对环丙沙星的敏感性有下降趋势。以上结果表明acrA、marA在黄芩苷的抗菌增敏作用中发挥着主要的作用,acrD发挥着次要的作用。