研究背景:胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase, TP )是嘧啶和核苷代谢过程中的关键酶,与血小板源性内皮细胞生长因子(platelet-derived endothelial cell growth factor,PD-ECGF)的结构和作用相似,被认为与PD-ECGF是同一物质。TP具有血管生成活性,与肿瘤的生长、转移等有密切关系,在胃、结肠、卵巢等部位的癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织,但结直肠癌组织中究竟是癌细胞还是间质细胞表达TP活性的问题,一直存在争议,关于TP的预后作用也未有一致意见。由于5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)的前体药物5’-脱氧氟尿苷(5’-deoxy-5-fluorouridine,5’-DFUR)、卡培他滨(capecitabine,CAP)等须经肿瘤组织内高表达的TP选择性激活转化为5-FU而发挥细胞毒作用,所以提高肿瘤内TP的活性有增强这些前体药物抗肿瘤的作用。我们前期体外实验显示类巨噬细胞表达的TP可以降低5’-DFUR对结肠癌胞的半数有效量(50% inhibiting concentration,IC50)。而多种细胞因子有上调TP表达的作用,我们前期的体外实验发现加入干扰素后,可以使5’-DFUR对结直肠癌细胞的IC50下降。本实验通过对结直肠癌标本以两种抗TP抗体染色,并收集部分临床资料进一步探索TP的表达以及TP与临床特征及预后间的关系;通过对小鼠结直肠癌肝转移模型应用5’-DFUR联合干扰素进行治疗,来探讨两药联合的抗肿瘤效果。材料与方法:实验一1、临床标本人结直肠癌标本53例取自广州医学院第二附属医院普外科1998年2月至2000年12月的手术标本。其中B期(Dukes分期)20例,C期22例、D期4例,未知分期7例;低分化腺癌4例、中分化腺癌37例、高分化腺癌2例,其它组织类型10例。肿瘤位于左半结肠的有11例,右半结肠19例、直肠20例、3例未知具体部位。肠息肉标本17例,腺瘤性10例,其他7例。2、抗体和试剂盒一抗采用小鼠抗TP单克隆抗体654-1(1:800)、小鼠抗TP单克隆抗体抗1C6-203(1:400),此2抗体由日本Roche Research Center提供。巨噬细胞标记物CD68的单克隆抗体PG-M1(1:100),购自DAKO公司(Denmark)。以小鼠非特异性抗体IgGI(1:100)(East Acres Biologicals, USA)为阴性对照。染色过程中所需的SP-2001试剂盒、二抗试剂盒、DAB试剂盒均购自美国Vector公司。3、染色结果的判定及细胞计数方法654-1和1C6-203抗体的阳性细胞表现为细胞核或细胞质棕黄色染色,偶尔也可见到单独细胞核黄染。CD68阳性细胞染色位于细胞膜呈铁锈色。先在低倍视野下选择5处阳性细胞最密集区,然后分别在400倍视野下(0.0625mm2)下进行计数,然后分别计算出每种阳性细胞的?x±s。4、统计学分析应用SPSS13.0统计分析软件包对数据进行Spearman相关及线性归分析,当P<0.05时,认为差异有统计学意义。实验二1、实验材料SPF级近交系BALB/c小鼠114只,6-8周龄,雄性,体重20.23±2.13g,购自中山大学实验动物中心。BALB/c小鼠结肠腺癌细胞株(CT26),购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)。5’-脱氧氟尿苷(5’-DFUR)由Roche公司日本研究中心提供;5-氟尿嘧啶(5-FU)注射液,江苏南通精华制药有限公司生产(批号:060507);聚乙二醇干扰素α-2a,商品名:派罗欣(180μg/0.5ml),购自上海Roche公司。2、实验方法脾注射法制备小鼠结直肠癌肝转移模型后,将114只小鼠随机分为6组,术后第三天开始给药;①生理盐水组:腹腔注射,NS 0.4ml×5天;②干扰素组:颈部皮下注射2mg干扰素×1天;③5-FU组:1mg/ml 5-FU,腹腔注射0.4ml×5天;④5-FU+干扰素组:②+③方案;⑤5’-DFUR组:5mg/ml,腹腔注射0.4ml×5天;⑥5’-DFUR +干扰素组:②+⑤方案。每组于术后第10天、15天分别随机处死6只小鼠;剩余小鼠待其自然死亡,记录生存时间。观测小鼠术前、术后第1、2、3周体重;术后10天、15天处死小鼠,摘眼球法取血,送检验科测谷草、谷丙转氨酶、尿素、肌酐;取处死小鼠肝脏、脾脏称重,计数肝脏表面结节数目,测量最大结节直径,观察结节有无融合。3、统计学分析肝脏表面结节计数资料转化为等级资料后,用χ2卡方检验比较;各组肝脏、脾脏重量、生化指标、平均体重变化比较采用单因素方差分析(ANOVA法);生存期的比较应用秩和检验法分析。所有统计应用统计软件SPSS13.0数据包完成,当P<0.05时,认为差异有统计学意义。结果:实验一、1、临床随访资料截至2007年10月,53例结直肠癌患者中有50例完整随访结果。其中23例死亡,在死亡患者中,除2例于术后死亡,其余21例最长存活82个月,最短6个月,平均26.8个月。现生存27例患者,最长者已生存115个月。2、免疫组织化学染色形态学表现见到TP阳性细胞主要分布于环绕癌巢的间质细胞中,这些细胞主要是巨噬细胞。癌细胞只有5例表现为654-1和(或)1C-6203阳性。CD-68阳性巨噬细胞的分布范围及部位与TP阳性细胞几乎一致。息肉组织中,TP阳性细胞和CD-68阳性细胞也分布于间质中,但不同抗体染色的范围和部位不太一致。3、免疫组织化学染色细胞计数分析654-1和1C6-203阳性细胞数相关,癌组织中(r = 0.661,P<0.001),息肉组织中(r=0.577,P<0.05)。在癌组织中654-1(r = 0.647, P<0.001)和1C6-203(r = 0.633,P<0.001)阳性细胞数分别与TAM细胞数相关,息肉组织中无相关。大肠癌组织与息肉组织TP阳性细胞数差异无统计学意义。不同的肿瘤部位(左右半结肠)、临床病理分期、分化程度、组织学分类间654-1抗体阳性细胞计数均无差异,P值分别为0.588、0.432、0.90、0.240。4、大肠癌患者生存期(月)与654-1抗体阳性细胞计数无相关关系,r =0.540, P<0.05。实验二、1、体重变化手术后10天, 5-FU组(-1.62±0.62g)和5-FU联合干扰素-α组(-1.23±0.78g)体重减少较其它组明显(P<0.05),手术后15天,该两组体重改变分别与生理盐水组和5’-DFUR组比较有差异(P<0.05)。2、肝脾重量及生化指标的比较术后10天,5-FU组和5-FU联合干扰素-α组的脾脏重量与生理盐水组、干扰素-α组、5’-DFUR联合干扰素-α组脾脏重量有差别(P<0.05),其它时间各组肝脾重量差异均无统计学意义。术后10天时肌苷(CREA)指标中5’-DFUR组(23.8±11.9 umol/L)与5’-DFUR+IFN组(38.7±19.1 umol/L)差异有统计学意义( P<0.05),15天谷草转氨酶指标5-FU组(161.3±21.9 U/L)与NS(354.5±292.9 U/L)对照组差异有统计学意义P<0.05。4、肝脏表面结节计数及小鼠生存期比较术后10天处死小鼠中,5-FU组与干扰素-α组、5’-DFUR联合干扰素-α组以及5-FU联合干扰素-α组与5’-DFUR联合干扰素-α组的肝脏表面结节计数差异有统计学意义(P<0.05),其与组间差异无统计学意义。各组生存期之间差异无统计学意义。结论:人结直肠癌组织中表达TP阳性的细胞主要是TAM。结直肠癌组织中TP阳性细胞的数目与患者预后生存的时间无相关。5’-DFUR联合干扰素-α无明显提高抗小鼠肿瘤效果的作用。