潞党参根际产ACC脱氨酶细菌的多样性调查及高效菌株的接种效应

来源 :山西师范大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:yzmxfyzm
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潞党参(Codonopsis pillosula),桔梗科党参属植物,主产于山西省晋东南地区,为山西省道地药材,药用价值较高。近年来随着人们对潞党参需求量的不断增加以及大量采伐使得野生潞党参资源逐渐面临紧缺。本文开展了山西晋东南地区潞党参根际土壤产ACC脱氨酶细菌多样性调查及高效菌株的接种效应研究,以山西省平顺县、长治县、陵川县和泽州县这4个地点作为采样区采集潞党参根际土样,通过富集定向筛选法和产ACC脱氨酶活性测定分离出潞党参根际土壤中具ACC脱氨酶活性的菌株,利用菌株的形态特征、生理生化特征、Biolog GenⅢ系统与16S rDNA分子鉴定技术对分离出的产ACC脱氨酶菌株进行鉴定和多样性调查,利用BIOLOG检测法研究4个采样区潞党参根际土壤微生物群落多样性,对筛选的高效菌株LDS17进行产IAA、产嗜铁素、产NH3、产HCN、溶磷和固氮等其它促生特性研究,并检测其产酶条件、耐盐和广谱抑菌性等特性。将菌株LDS17接种于潞党参盆栽苗根际,测定不同接种时间潞党参幼苗苗高、地径、生物量、叶绿素含量、根际可培养微生物数量、土壤酶活及土壤微生物功能多样性。以上研究为潞党参的丰产栽培以及复合微生物菌肥的研制提供理论基础。主要研究结果如下:1、本研究选择潞党参主要产区的4个不同产地,共分离出33株产ACC脱氨酶细菌,隶属于5属10种,其中产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)21株,暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)1株,B.nakamurai 1株,金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum)1株,阿耶波多芽孢杆菌(B.aryabhattai)3株,巨大芽孢杆菌(B.megaterium)2株,病研所芽孢杆菌(B.idriensis)1株,特基拉芽孢杆菌(B.tequilensis)1株,醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)1株,Pseudomonas brassicacearum1株,其中产酸克雷伯氏菌LDS17活性最强,这将为根际有益菌应用于潞党参的栽培及种质创新提供了丰富的菌种资源。2、高效菌株LDS17具产IAA、嗜铁素、产NH3、产HCN、固氮、溶磷等促生特性,并可以忍受6%的盐浓度。对高效菌株LDS17进行产酶条件的研究,确定了其产酶条件的最适pH值、最适温度、最佳培养时间、最佳转速分别为6、30℃、24 h和150 r/min,在分别以果糖为碳源、蛋白胨为氮源和氯化钠为无机盐时,菌株LDS17的酶比活力最高。另外该菌株对供试病原菌棉花立枯菌(Rhizoctonia solani)、葡萄炭疽菌(Grape anthracnose)、油茶炭疽菌(Camellia oleifera anthracnose)、苹果轮纹菌(Dothiorella gregaria)、七叶树壳梭孢菌(Fusicoccum aesculi)、拟茎点霉菌(Phomopsis macrospore)、丝核菌(Rhizoctonia sp.)、金黄壳囊孢菌(Cytospora chrysosperma)都具有一定的抑菌性。3、培养达到168h时,4个采样地AWCD值表现为PS>ZZ>LC>CZ,4个样地潞党参根际土壤微生物Shannon指数、McIntosh指数均存在显著差异(P<0.05),Simpson指数差异不显著(P>0.05)。4个样地的Shannon指数大小顺序为ZZ>PS>CZ>LC;Simpson指数大小顺序为PS>ZZ>LC>CZ;McIntosh指数大小顺序为ZZ>PS>LC>CZ。4个采样地对碳源利用情况从高到低依次为:ZZ>PS>LC>CZ,其中对碳源利用程度最高的分别为L-天门冬酰胺、L-天门冬酰胺、D-苹果酸和吐温80。4、成功获得菌株LDS17的GFP基因标记菌株,荧光显微镜下可以看到发绿色荧光的标记菌株,用稀释平板涂布法对根际土壤中GFP标记菌株进行定期回收检测发现,接种5 d时潞党参根际土壤中LDS17转化菌体数量为4.7×103CFU/g,且随着接种时间的延长标记菌株菌体数量逐渐增多,接种25 d时,菌体数量达到1.07×104 CFU/g;用荧光显微镜对接种40 d后潞党参的根部进行观察,发现有大量绿色荧光的GFP标记菌株存在,进一步说明GFP标记菌株LDS17能在潞党参幼苗根部长期稳定地定殖。5、接种菌株LDS17 30 d、60 d和90 d后实验组苗高、地径、生物量、叶绿素含量、土壤可培养微生物数量(细菌、放线菌和真菌)和土壤酶活(蔗糖酶、脲酶和过氧化氢酶)均高于对照组;接种菌株LDS17后能提高其根际土壤微生物的AWCD值、功能多样性指数及微生物对碳源的利用率。6、将潞党参盆栽幼苗培养到60 d后,对各组进行不同水分处理:干旱处理和正常水分处理,20 d后分别对各组进行苗高、丙二醛含量、可溶性蛋白含量、SOD活性、POD活性和CAT活性进行测定。结果表明,干旱条件下接种菌株LDS17后相比于对照组而言潞党参苗高和可溶性蛋白含量增多,相比于对照组而言潞党参SOD活性、POD活性和CAT活性增强,潞党参丙二醛含量减少。
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