纳米抗体（nanobody，Nb）是一类只含重链可变区的单域抗体，存在于骆驼及一些软骨鱼类体内。目前，利用基因工程技术可实现纳米抗体真核和原核表达。尽管纳米抗体相比传统抗体而言具有良好的可溶性，但由于不同纳米抗体空间结构存在较大差异，因此，使用原核表达系统进行纳米抗体表达时，仍会存在表达量、可溶性以及活性较低等问题。为解决这类问题，一般使用融合标签技术，即在目的蛋白的N端或C端融合可溶性的某种或多种标签。本研究为了获得猪圆环病毒II型（PCV2）Cap蛋白纳米抗体的最佳原核表达系统，我们选取两种空间结构完全不同的PCV2Cap蛋白的纳米抗体为模型，选用三种分别带有MBP、SUMO、His融合标签的原核表达载体pMAL-c2x、pE-SUMO、p-COLD DNA I。然后从表达量、可溶性以及抗原结合活性三方面对两种纳米抗体进行比较，结果发现pE-SUMO表达载体更有利于纳米抗体的原核表达，SUMO标签较MBP和His标签更适用于纳米抗体的原核表达，且当SUMO标签去除后，并不影响处于天然状态下的纳米抗体的抗原结合活性。以上结果可为其他纳米抗体的原核表达提供参考。目前，检测PCV2主要采用间接ELISA方法。此法是通过检测血清中特异性抗体来判断PCV2的感染情况，但此法却无法准确检测出已感染但尚未产生特异性抗体的动物。因此，建立一种以检测PCV2抗原为目的的双抗体夹心ELISA会比传统的间接ELISA更有效。找到一种特异性结合活性好、稳定性高的抗体作为包被抗体是建立双抗体夹心ELISA方法的关键。基于此，本研究利用pE-SUMO表达载体对实验室前期筛选获得的6种不同序列的PCV2Cap蛋白纳米抗体进行表达，不同温度处理6种纳米抗体，结果发现6种纳米抗体的耐热性均较高。通过耐热性研究找出结合活性较好且稳定性较高的抗PCV2Cap蛋白纳米抗体，为后续建立PCV2双抗体夹心ELISA检测方法提供关键的抗体工具。本研究的主要内容和结果如下：1.三种纳米抗体表达载体的构建通过引入限制性酶切位点BamH I和Sal I，将抗猪圆环病毒II型Cap蛋白纳米抗体（Nbs）连入经相同酶酶切处理后的pCold、pMAL-c2x表达载体，构建重组纳米抗体表达载体pCold-Nbs、pMAL-c2x-Nbs；通过引入限制性酶切位点Bsa I和BamH I，将Nbs连接入经过相同酶酶切处理后的pE-SUMO表达载体，构建重组表达载体pE-SUMO-Nbs。2.融合纳米抗体的诱导表达及比较重组质粒pMAL-c2x-Nbs、pE-SUMO-Nbs、pCOLD-Nbs分别转化感受态细胞TB1、Rosetta、BL21（DE3），分别在0.3mmol/L IPTG37℃3h、0.4mmol/L IPTG25℃4h、0.4mmol/L IPTG15℃6h条件下进行诱导表达。12%SDS-PAGE电泳分析可溶性表达情况，结果MBP标签促溶性效果最明显；BCA试剂盒测定融合纳米抗体产量，大小为His-SUMO-Nbs>MBP-Nbs>His-Nbs；间接ELISA检测融合纳米抗体的抗原结合活性，MBP-Nbs、His-SUMO-Nbs、His-Nbs均能识别特异性抗原（猪圆环病毒II型Cap蛋白），但却存在显著差异（P〈0.05），活性最大的为His-SUMO-Nbs，而MBP-Nbs活性最低。综合分析后得出SUMO标签较MBP、His标签更适合用于纳米抗体的原核表达，融合SUMO标签的pE-SUMO表达载体较其余两种载体表达纳米抗体更具优势。3.SUMO标签的切除及天然纳米抗体活性检测使用SUMO蛋白酶1（Ulp1）酶切His-SUMO-Nb2以移除SUMO标签，通过TALONMetal Affinity Resin纯化获得天然的Nb2。双抗体夹心ELISA检测Nb2活性，并与His-SUMO-Nbs活性进行比较，结果与阴性对照相比纳米抗体反应值均为阳性（S/N〉2.1），天然单体Nb2与His-SUMO-Nb2两者的抗原结合活性反应值较为接近，差异不显著（P〉0.05），表明SUMO标签的存在对纳米抗体的抗原结合活性不会有影响，进一步说明SUMO标签为纳米抗体原核表达的最佳标签。4.猪圆环病毒II型Cap蛋白纳米抗体耐热性研究采用pE-SUMO原核表达载体将筛选得到的6种抗猪圆环病毒II型Cap蛋白纳米抗体进行表达。温度处理后，间接ELISA检测6种纳米抗体的抗原结合活性。结果显示虽然6种纳米抗体活性都有所减少，但相对血清抗体而言，抗猪圆环病毒II型Cap蛋白纳米抗体在高温条件下仍表现出结合抗原的能力，表明其具有良好的耐热性。比较ELISA结果发现猪圆环病毒II型Cap蛋白纳米抗体Nb2的稳定性较其余纳米抗体更好，并且Nb2原始的抗原结合活性也较好，因此，可将其作为包被抗体用于建立检测PCV2双抗体夹心ELISA的研究中。