ROP已经达到儿童总致盲原因的6～18％，防治ROP以改善早产儿的生存质量己成为全球关注的焦点。充分了解其发病过程中缺氧诱导的视网膜新生血管形成机制对ROP等疾病的诊断、治疗、预防将起到重要的作用。另外，视网膜新生血管形成也是视网膜静脉栓塞、增殖性糖尿病视网膜病变等众多视网膜新生血管性疾病的共有病理变化之一。本课题在建立氧诱导视网膜病模型（Oxygen-induced Retinopathy，OIR）的基础上，应用iTRAQ^TM结合二维纳米高效液相色谱／串联质谱联用技术研究ROP发生过程中蛋白表达谱的变化规律及意义，探讨ROP的发病机制。建立OIR及正常小鼠视网膜组织蛋白质组表达图谱，定量比较OIR视网膜组织及正常视网膜组织蛋白质组的差异表达，对差异表达的蛋白质进行质谱分析和数据库搜索，确定OIR组织中特异表达的蛋白质，为进一步研究其在缺氧性视网膜疾病发生、发展中的作用，探索其与缺氧性视网膜疾病诊断、治疗、预后规律的相关性奠定基础。课题的主要研究方法和内容有：1．氧诱导视网膜病变小鼠模型的建立及观察选用C57BL／6J小鼠，在第7天时放入氧含量为80％的氧箱中连续饲养5天，然后恢复到正常环境中饲养，构建OIR视网膜病变模型。应用ADP酶染色法、高分子荧光素灌注法显示OIR小鼠及正常对照小鼠从出生当天（P0）至生后17天（P17）视网膜铺片中的血管变化情况，并结合观察相同时期的视网膜连续病理切片，对正常小鼠视网膜血管发育、OIR小鼠视网膜新生血管形成过程及规律进行研究。2．视网膜的处理及组织蛋白的提取无菌条件下将P17 OIR小鼠及正常对照组小鼠视网膜组织取出，用生理盐水清洗两次，尽可能吸除玻璃体组织，保存于液氮中。组织样品于液氮下充分研磨至粉术状，置于组织裂解液中提取总蛋白质，利用MicroBCA^TM Protein Assay法测出蛋白质总浓度后保存于-80℃低温冰箱备用。3.iTRAQ^TM结合二维纳米高效液相色谱／串联质谱联用技术（2D nanoLC-MS／MS）将两组各20个样本分为混合、个体，采用先使用混合样本寻找差异蛋白再使用个体样本进行验证的研究路线。使用iTRAQ试剂标记OIR和同期对照组小鼠视网膜蛋白，分别使用114、115标记对照组；116、117标记OIR组。将标记好的样本加入二维纳米高效液相色谱／串联质谱仪中进行检测，收集检测数据。4．生物信息学数据检索利用ProteinPilot等软件对质谱图谱数据进行分析，结合相应蛋白质点氨基酸序列的覆盖率进行蛋白质鉴定获得视网膜蛋白组资料，并计算iTRAQ比率进行蛋白质的相对定量比较，发现差异蛋白质。在SWISS-PROT数据库进行搜索，获得对应蛋白质的功能、定位等各项资料，对所得蛋白质信息进行聚类分析、差异分析等生物信息学研究。研究的主要结果有：1．小鼠视网膜血管发育正常小鼠刚出生时，视网膜中暂无血管分布，但可见散在分布的ADP酶阳性细胞。此时，在视网膜表面可见密集的玻璃体血管网。之后，视网膜血管以自中心向周边和自内层向外层的规律逐渐发生。在血管从视网膜内层向外层发生的过程中，约在P12先从内层向外发出较大的螺旋形血管，再进一步形成外层血管网。至P17，视网膜血管发育基本成熟，而玻璃体血管则退化。2．OIR新生血管生成从P7开始，将C57BL／6J小鼠置于80％的高氧环境中饲养5天后，P12天可见网膜血管的减少萎缩，P14即可看到有紊乱的新生血管生成，随时间延长异常新生血管增加，到P17可见异常的新生血管突破视网膜内界膜进入玻璃体，达到高峰，视网膜深层血管和交通支没有正常形成，表明小鼠OIR模型制备成功。3．蛋白质组分析结果在P17的正常小鼠、OIR小鼠视网膜中共鉴定到261种蛋白质表达，与视觉功能有关／信号蛋白48种、细胞周期蛋白4种、细胞结构功能蛋白46种、染色体相关蛋白33种、代谢相关蛋白84种、细胞基质／细胞连接蛋白14种、免疫相关蛋白11种、其中尚有21种蛋白尚未了解其功能。4．定量差异蛋白质鉴定结果iTRAQ^TM标记法共检测到在OIR小鼠视网膜中有29种差异表达的蛋白质，结果提示，差异表达的蛋白较为分散，血管生成相关基因的表达在整个改变中只占很小的比例。主要是细胞成分蛋白及生物过程相关蛋白的改变，分子功能蛋白中，主要是酶类和核酸结合蛋白的改变。细胞成分蛋白中有4种晶体蛋白均有明显下调、3种与血液成份相关蛋白明显上调，细胞外基质蛋白成分的改变也有表现。研究的主要结论有：1．小鼠是研究视网膜血管发育与血管新生的良好模型。ADP酶染色或荧光素灌注法结合视网膜铺片可良好的显示视网膜血管结构。2．80％高氧可成功诱导小鼠OIR模型，并可用于相应的缺氧性视网膜新生血管发病机制及治疗效果研究。3．2D nano LC-MS／MS对视网膜组织蛋白组的测定可取得较理想的鉴定结果，通过该方法我们鉴定到261个在OIR小鼠视网膜和正常小鼠视网膜表达的蛋白质，建立小鼠视网膜蛋白质组数据。4．iTRAQ^TM标记方法可以有效对多个样本的同时进行定量比较研究，通过该标记我们共检测到在OIR小鼠视网膜中有29种差异表达的蛋白质，其中14种上调，15种下调。3种与血液成份相关蛋白明显上调，有4种晶体蛋白均有明显下调，提示晶体蛋白在视网膜新生血管形成中可能起到重要的作用。研究特色及意义：1．以OIR小鼠视网膜为模型，对视网膜缺氧性新生血管的发生和正常血管发育进行研究，提出了视网膜发育中神经胶质—神经元—内皮细胞—内分泌之间的相互作用的设想。2．使用新型的iTRAQ^TM结合二维纳米高效液相色谱／串联质谱联用技术构建了正常及OIR小鼠视网膜蛋白质组数据，为今后以小鼠为模型的视网膜研究奠定了研究数据基础，为今后使用该方法对微量视网膜标本进行研究进行了尝试。3．从蛋白质网络的角度研究ROP等缺氧性视网膜病的发病机制，鉴定到在OIR视网膜中有29种明显表达差异的蛋白质，其中多种蛋白的变化，如4种晶体蛋白同时明显下降，提示其在视网膜新生血管发生中的作用，为下一步研究提供了新的线索。