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目的:宫颈癌的发生、发展中存在DNA甲基化水平和模式的紊乱,DNA甲基化异常可影响癌基因和抑癌基因的表达而参与肿瘤的形成。天花粉蛋白(TCS)具有对多种高甲基化状态的抑癌基因启动子进行去甲基化的作用,并由此上调这些抑癌基因的表达水平,但是TCS发挥去甲基化的机制尚未阐明。在前期天然天花粉蛋白(nTCS)能够抑制宫颈癌细胞增殖和逆转抑癌基因启动子甲基化的研究基础上,本课题重点研究nTCS抗宫颈癌和去甲基化的机制。 方法:1.利用重叠延伸PCR得到活性位点突变的天花粉蛋白(mTCS)的目的片段,将其插入到pET-28a(+)空载中,成功构建的表达质粒pET-28a(+)-mTCS转化入E.coli BL21(DE3)细胞,IPTG诱导表达mTCS,用金属镍螯合层析法纯化mTCS后进行Western-blot鉴定;2.酶活性分析检测mTCS生物活性,MTT法检测mTCS和nTCS对宫颈癌 HeLa细胞增殖的影响,流式细胞术检测mTCS和nTCS对宫颈癌细胞周期的影响;3甲基化特异性PCR(MSP)检测人宫颈癌Hela细胞中APC基因启动子区域CpG岛甲基化状态,反转录PCR(RT-PCR)和半定量PCR法研究mTCS和nTCS对APC基因mRNA表达水平的影响,Western-blot法检测mTCS和nTCS对APC基因蛋白表达水平的影响。 结果:1.IPTG可诱导mTCS在E.coli中表达,温度较低的培养环境(30℃)有利于表达;用Ni2+-NTA树脂亲和层析法从诱导表达菌中获得了较高纯度的mTCS;DNA酶活性检测发现删除核糖体活性位点的天花粉蛋白体外切割超螺旋DNA的作用丧失;2.MTT法分析表明在0-100μg/mL的浓度范围内,随着药物浓度的增加,nTCS对 HeLa细胞的生长抑制率逐渐增大,与对照组相比存在显著差异(P﹤0.01),不同浓度 mTCS处理对细胞生长没有明显的抑制作用;流式细胞仪检测发现nTCS可以阻滞细胞于 S期,从而抑制宫颈癌细胞生长,mTCS不能发挥这一作用;3.MSP法检测发现宫颈癌HeLa细胞中APC基因为高甲基化状态,80mg/L nTCS处理48h后,APC基因启动子区去甲基化,但是经80mg/L mTCS处理后 APC基因高甲基化状态没有改变;RT-PCR分析发现,在TCS处理前APC基因mRNA水平为低表达,经80mg/L的mTCS处理后mRNA表达水平没有变化,但经80mg/L的nTCS处理后mRNA表达水平显著升高;Western-blot法检测Hela细胞APC蛋白水平的变化发现,与对照细胞比较,80mg/L mTCS处理的Hela中APC蛋白含量无显著变化,但经80mg/L nTCS处理的细胞内APC蛋白含量显著增高。 结论:本实验成功地在E.coli中原核表达和纯化出mTCS,DNA酶活性检测发现删除核糖体活性位点的天花粉蛋白体外切割超螺旋 DNA的作用丧失,nTCS能够抑制宫颈癌 HeLa细胞的增殖,并且能够阻滞 HeLa细胞周期于S期,从而发挥抗肿瘤药理作用。纯化的mTCS对HeLa细胞的增殖没有明显抑制作用。宫颈癌HeLa细胞中APC基因为高甲基化状态,nTCS能逆转宫颈癌HeLa细胞APC基因高甲基化状态,上调APC基因mRNA和蛋白水平的表达,但是mTCS没有这些作用。上述研究提示,天然天花粉蛋白发挥其抗癌作用和去甲基化作用与其蛋白分子内核糖体失活功能位点相关。