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肝癌是我国临床中一种常见的恶性肿瘤疾病,经统计显示其死亡率很高。研究结果显示,乙型、丙型等肝炎病毒是肝癌疾病的主要发病因素,提示肝脏炎症与肝癌疾病的发病有密切关系。此外,在信号转导方面的相关研究中可以发现,Wnt/β-catenin信号通路除了在干细胞发育过程中发挥重要作用以外,还与肝癌的发生发展等过程有着一定的联系。在生物进化过程中的众多通路中,Wnt/β-catenin信号转导通路极为保守,也保持了高度的同源性。大量研究显示,在动物胚胎的发育过程中,此通路还参与了多个不同的领域。此外,在肝脏组织的生长和更新过程中,Wnt/β-catenin信号通路也起着调控的关键性作用。上世纪八十年代,科研人员才发现了Wnt/β-catenin信号和肿瘤发生、发展之间的联系。而关于Wnt/β-catenin信号转导通路在肝癌疾病的发生、发展过程中的作用越来越受到密切的关注,目前研究发现,通过对下游靶基因的激活,Wnt/β-catenin信号通路可导致肝癌疾病的发生、发展等过程。因此,近些年来在Wnt/β-catenin信号通路方面的针对性治疗逐渐成为研究的新热点。与cyclinDl、c-myc等基因一样,LGR5也是一种受到Wnt信号转导通路调节的靶基因。大量研究结果提示,LGR5在不同的肿瘤疾病(肝细胞癌,结肠癌,卵巢癌,皮肤基底细胞癌)中的表达水平均有不同程度的升高。富含亮氨酸重复单位的G蛋白偶联受体5( leucine rich repeat containing G protein coupled receptor 5, LGR5)首先从结直肠癌细胞中分离出来。近些年来,研究者在肝癌及卵巢癌等细胞中也发现了LGR5基因的表达,实验结果证实:LGR5基因是Wnt信号传导途径的靶基因。荷兰研究学者发现, LGR5仅仅在人体的小肠、结肠隐窝基底柱状上皮细胞呈特异性的表达,此基因编码产物为阳性的细胞具有干细胞的各种生物学活性,且还证实了LGR5是小肠、结直肠干细胞的标记物,因此推测认为:LGR5可能是多种不同肿瘤干细胞的标志物。目前的相关临床研究资料也显示,有部分患有肝细胞癌的病人,其LGR5的过度表达现象和Wnt信号转导通路中最关键的效应物基因(β-catenin)的第3外显子发生突变现象之间的关系十分密切。因此本课题进行了以下几个方面的研究:1. LGR5启动子质粒的构建;2. LGR5在各种肝癌细胞中表达情况;3.LGR5在肝癌组织及其癌旁组织中的表达情况。通过上述实验旨在证实,Wnt信号通路出现异常激活现象后可以明显上调LGR5的表达水平,推测Wnt信号通路对肝细胞的异常增殖现象和肝脏肿瘤的发生发展等过程中发挥着相当重要的作用,有望成为肝细胞癌疾病的一个新的治疗靶点。实验方法:1、LGR5启动子质粒的构建:采用PCR方法扩增LGR5启动子不同长度片段,回收目的片段将其插入pGL4.21载体中,构建了7个不同长度的报告基因质粒,然后分别转染到SW480和HCT116细胞中,并进行启动子活性检测和活性调节的研究;2、LGR5在各种肝癌细胞中表达情况:成功培养4种肝癌细胞(HepG2、Hep3B、Huh7和PLC)和正常肝脏细胞L02,采用western-blot、Real-time PCR等方法检测LGR5在4种肝癌细胞中的表达情况;3、LGR5在肝癌组织及其癌旁组织中的表达情况:采用免疫组织化学方法检测36例肝癌及其癌旁组织样本,观察LGR5在肝癌组织和癌旁组织中的阳性率表达情况。结果:1、经鉴定,7种LGR5启动子质粒均构建成功,转染细胞后进行检测,LGR5启动子F1-F6在SW480和HCT116细胞中,均有很高的活性,并且在HCT116中活性更高。F7与其余各组相比活性明显降低,说明-645～-330之间为启动子活性关键区域。此外还发现,共转AC133或β-Catenin后F1活性增强,在SW480和HCT116细胞中变化趋势一致,且在HCT116细胞中变化更明显。2、LGR5在肝癌细胞中呈低表达,与正常肝脏细胞L02(L02:1.2±0.10)相比较,LGR5蛋白在四种肝癌细胞中表达水平依次为(HepG2=0.7±0.04, Hep3B=0.4±0.03, Huh7=0.12±0.07, PLC=0.3±0.04),均明显出现下调(P<0.01)。在huh7细胞中几乎不表达。但是与其它三种肝癌细胞株相比,HepG2细胞株中LGR5蛋白的表达稍高。与正常肝脏细胞L02相比,四种肝癌细胞的LGR5 mRNA表达水平依次为( HepG2/L02=0.3±0.04 , Hep3B/L02=0.08±0.03 , Huh7/L02=0.02±0.01 ,PLC/L02=0.1±0.04),均明显下调(P<0.01),此结果与Western blot检测结果相一致。其中Huh7细胞下调最为明显,达到20倍(P<0.01)。3、与肝癌癌旁组织相比较,LGR5在肝癌组织的表达水平出现明显的下调趋势,其中36例肝癌组织样本中,阳性表达仅6例(16.7%),阴性表达30例(83.3%);而在肝癌癌旁组织中,阳性表达27例(75.0%),阴性表达仅9例(25.0%),癌组织中LGR5阳性表达例数较癌旁组织明显减少(P<0.01)。在阳性病例中,LGR5主要分布在细胞浆及胞膜中,极少分布在细胞核中。结论:通过上述实验结果可知,CD133或β-Catenin可在启动子水平方面明显上调LGR5的表达水平,LGR5是一种Wnt信号转导通路的靶基因,在Wnt信号转导通路出现激活现象以后,可以引起LGR5表达水平的下调或上调,可能对肿瘤细胞的增殖、分化现象,以及肿瘤的形成过程中发挥关键性的生理作用,从而最终影响肝癌的发生发展等过程。LGR5作为最新研究的干细胞标记物,对于肝癌的早期筛查诊断,指导临床治疗及判断预后等方面具有十分重要的意义。