目的：　　研究临床分离的革兰阴性菌中不同种属细菌对碳青霉烯类药物的耐药情况;了解革兰阴性菌中不同种属细菌中碳青霉烯酶耐药基因分布;同时探讨碳青霉烯酶耐药基因在不同菌属中的播散特性，为临床用药及控制医院感染提供依据。　　方法：　　1、回顾性分析2008～2012年间温州医科大学附属第一医院临床分离革兰阴性杆菌对碳青霉烯类药物的耐药情况，了解5年间不同菌属对碳青霉烯类药物的耐药趋势。　　2、碳青霉烯类药物对碳青霉烯耐药革兰阴性菌的MIC值检测:采用琼脂稀释法检测碳青霉烯类药物亚胺培南、美罗培南和厄他培南对碳青霉烯耐药革兰阴性菌的最低抑菌浓度值(MICs)，结果根据2013年CLSI的标准判读。　　3、碳青霉烯酶表型检测:采用改良的Hodge实验对碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌进行碳青霉烯酶的表型检测。　　4、碳青霉烯酶基因检测: PCR检测碳青霉烯耐药的肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌中的A类碳青霉烯酶基因、B类金属酶基因和D类blaOXA-48基因，PCR检测碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌中的blaOXA-23，-24,-51,-58、 blaIMP、 blaVIM，、blaGIM、blaSIM-1、 blaSPM、 blaNDM-1基因，对PCR阳性产物进行测序确认，分析革兰阴性菌中不同菌属中主要流行的碳青霉烯酶基因。　　5、碳青霉烯酶基因水平转移研究:采用接合转移试验分析碳青霉烯酶基因阳性细菌中的碳青霉烯耐药基因的水平转移特性。　　6、耐碳青霉烯革兰阴性菌的流行性研究:脉冲场凝胶电泳分析耐药菌株之间的同源性，研究携带碳青霉烯酶基因的各菌属细菌在院内的流行特性;同时用多位点测序分型方法(MLST)检测碳青霉烯酶基因阳性的肺炎克雷伯菌的ST型，明确流行的主要ST型，并与国际流行型进行比较。　　结果：　　1、2008～2012年从临床标本中分离的3139株革兰阴性菌中，对碳青霉烯酶耐药的菌株共754株(24.0％)，鲍曼不动杆菌对碳青霉烯的耐药率最高，达82.3％，其次是铜绿假单胞菌(36.6％)，不同菌属肠杆菌科细菌对碳青霉烯的耐药性表现不一，本研究肠杆菌科菌中耐药率最高的是沙雷菌属(22.1％)，其次是枸橼酸菌属(9.0％)，肠杆菌属(7.7％)，克雷伯菌属(2.2％)和埃希菌属(0.4％)，未在变形家族细菌中发现对碳青霉烯耐药的菌株。不同菌属中对碳青霉烯耐药细菌的标本来源都以痰液最多，菌株各临床科室分布不一，整体无明显的病区集中趋势，主要分布于重症监护病房(ICU)、神经外科和烧伤科。　　2、5年间本院鲍曼不动杆菌对碳青霉烯的耐药率呈逐年上升的趋势，且每年的耐药率都高于全国CHINET的监测结果;5年间铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物的耐药率没有明显的上升趋势，但耐药率波动较大，且均高于全国CHINET耐药性监测结果，本院肠杆菌科细菌对碳青霉烯的耐药率低于全国CHINET的监测结果，且5年间对碳青霉烯的耐药率波动不大，呈平稳状态。　　3、药敏检测结果显示不同菌属细菌对不同种类的碳青霉烯类抗生素的耐药性呈现不均一性，肠杆菌科细菌对厄他培南的耐药率最高(98.6％)，其次是亚胺培南(62.0％)，对美罗培南的耐药率最低(47.3％)，大肠埃希菌和肠杆菌属细菌主要对厄他培南耐药，肺炎克雷伯菌和沙雷菌属对三种药物全部耐药，而鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌几乎同时对亚胺培南和美罗培南耐药。　　4、74株碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌中改良Hodge试验阳性49株（阳性率为62.1％），PCR法检测得到碳青霉烯酶基因阳性菌株53株，其中43株携带blaKPC-2，10株菌携带blaIMP，其中1株菌携带blaMP-4，9株菌携带blaIMP-8;102株耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌均携带blaOXA-51基因，其中82株菌携带blaOXA-23，另外有8株菌携带blaIMP。170株碳青霉烯酶耐药的铜绿假单胞菌中有15株菌(8.8％)携带两种类型的碳青霉烯酶基因:其中8株菌携带blaIMP-1，7株菌携带blaVIM的菌株中，5株携带blaVIM-2，2株携带blaVIM-4。　　5、接合转移试验发现53株碳青霉烯酶基因阳性的肠杆菌科细菌中有16株菌的碳青霉烯酶基因（包括blaKPC和blaIMP）被成功转移到受体菌中，16株接合菌株相应的供体菌类型广泛，包括大肠埃希菌，肺炎克雷伯菌，枸橼酸菌，沙雷菌和肠杆菌，接合菌株与受体菌相比其对碳青霉烯类药物的MIC值均有不同程度的提高，提示碳青霉烯酶基因可以通过接合转移的方式在不同种属细菌间传播。而铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌中的碳青霉烯酶基因未成功转移到受体菌。　　6、脉冲场凝胶电泳分析发现本院对碳青霉烯耐药的鲍曼不动杆菌和粘质沙雷菌存在广泛的克隆传播现象，肠杆菌属细菌中也发现3株具有同源性的细菌，同时发现4株分离自不同年份和不同科室的携带KPC的肺炎克雷伯菌具有相同的克隆型，对产KPC的肺炎克雷伯菌进行MLST分型发现共分为6种ST型，其中4株有相同克隆型的菌株为国内广泛流行的ST11型，其余株分别为ST880，ST65，ST23，ST730，ST622。铜绿假单胞菌表现为高度异源性，提示医院内感染的铜绿假单胞菌并非以患者之间的传播为主，多为患者独立感染环境中的病原体。　　结论：　　1、本研究革兰阴性菌中鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率较高，高于国内外的报道，肠杆菌科细菌对碳青霉烯的耐药率低于国内报道。　　2、不同菌属细菌对不同种类的碳青霉烯类抗生素的耐药性存在差异，肠杆菌科细菌对厄他培南的耐药率最高，而鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌几乎同时对碳青霉烯类药物全部耐药。　　3、本院碳青霉烯耐药的肠杆菌科细菌中分布的碳青霉烯酶基因是blaKPC和blaIMP，且基因的菌株分布广泛，鲍曼不动杆菌中的碳青霉烯酶基因主要是blaOXA-23，与鲍曼不动杆菌不同，碳青霉烯酶在铜绿假单胞菌中的分布率较低，其不是铜绿假单胞菌对碳青霉烯耐药的主要原因。　　4、blaKPC和blaIMP可通过接合转移的方式在肠杆菌科不同菌属间传播，提示这些基因存在跨种属间传播的危险性。　　5、本院耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌、粘质沙雷菌、肠杆菌属和肺炎克雷伯菌均存在克隆传播的现象，且存在产KPC肺炎克雷伯菌的国内流行克隆型，提示碳青霉烯酶基因垂直传播的风险。