论文部分内容阅读
禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(APEC)引起的一种可导致鸡胚和幼鸡大量死亡的传染病,该病以急性致死性肠炎、腹膜炎、输卵管炎、亚急性心包炎、大肠杆菌性肉芽肿以及脓毒败血症为主要临床症状,是一种常见的禽病,给世界养禽业造成了重大经济损失。致病性大肠杆菌血清型众多,其中O1、02和078是引发禽大肠杆菌病的主要血清型,APEC可通过呼吸道和胃肠道进入血液造成系统感染。同时,由于APEC血清型多,抗原结构复杂,对禽大肠杆菌病的防治带来困难。基于APEC主要经肠道感染的特点,通过刺激机体肠道黏膜免疫系统诱导黏膜免疫是抗APEC感染的有效途径。本研究以乳酸菌为免疫抗原传递载体,构建靶向肠道微褶皱细胞(M细胞)和树突状细胞(DC)传递APEC的fimA和ompC蛋白的重组乳酸菌系统,探索利用基因工程乳酸菌经口服免疫诱导机体黏膜免疫抗APEC感染的可行性。本研究从鸡肠道中分离获得了 8株乳酸菌菌株,定殖能力检测结果显示,L.saerimneri(M11)菌株的定殖能力最强,且该株鸡源学乳酸菌菌株的益生性优于作为疫苗传递载体通常使用的干酪乳杆菌L.casei。因此,本研究以L.saerimneri(M11)菌株作为免疫抗原传递载体进行相关研究。本研究利用筛选出的L.saerimneri(M11)菌株为抗原传递载体,以禽致病性大肠杆菌fimA和ompC为免疫原,联合DC靶向肽DCpep和M细胞靶向肽Co1,利用组成型表达载体pPG-T7g10-PPT,分别构建了靶向M细胞和DC传递fimA和ompC蛋白的重组L.saerimneri(M11)系统pPG-T7g10-PPT-OmpC-fimA-Co1-DCpep/M-11(pPG-OF-Col-DCpep/M11)和非靶向重组L.saerimneri(M11)系统 pPG-T7g10-PPT-OmpC-fimA/M-11(pPG-OF/M11)。本项目评价了重组乳酸菌耐受消化环境性能和肠道定殖能力,检测结果显示,构建的重组乳酸菌pPG-OF-Col-DCpep/M11和pPG-OF/M11具有良好的消化环境耐受能力和肠道定殖能力。将重组乳酸菌pPG-OF-Col-DCpep/M11 和 pPG-OF/M11 在 MRS 液体培养基中 37℃静置培养 16 h,通过 Western blot方法鉴定目的蛋白的表达,Western blot检测结果显示,目的蛋白获得正确表达,表明目的蛋白获得组成型表达。本研究采用MLR方法评价了靶向M细胞和DC传递抗原的重组乳酸菌pPG-OF-Col-DCpep/M11和非靶向传递抗原的重组乳酸菌pPG-OF/M11调节鸡骨髓源DC成熟的能力,结果显示,靶向M细胞和DC传递抗原的重组乳酸菌pPG-OF-Co1-DCpep/M11刺激DC成熟能力强于非靶向传递抗原的重组乳酸菌pPG-OF/M11。同时,本研究以SPF雏鸡为实验动物,经口服途径免疫,系统性评价了重组乳酸菌pPG-OF-Co1-DCpep/M11和pPG-OF/M11的免疫原性。将SPF雏鸡分成4组,每组35只,分为:pPG-OF-Co1-DCpep/M11(实验组)、pPG-OF/M11(实验组)、M11组和PBS组(对照组)。免疫程序为:共免疫两次,每次持续免疫3天,每天1次,并于初次免后的第14,15和16天进行加强免疫。免疫后第0、4、7、10、14、17、21、28和35d采集各组实验SPF鸡粪便样本,以及于免疫后第0、7、14、21和35d采集各组实验SPF鸡血清、肠液和鼻腔洗液样本,用于免疫后抗体水平的检测,同时对免疫后的SPF鸡进行攻菌APEC(E.coli CVCC1553),以评价重组乳酸菌 pPG-OF-Co1-DCpep/M11和pPG-OF/M11 的免疫保护效果。结果显示:与对照组相比,口服免疫重组乳酸菌pPG-OF-Co1-DCpep/M11和pPG-OF/M11后,均诱导SPF雏鸡产生了显著水平的特异性抗fimA和ompC的黏膜抗体IgA和血清抗体IgG(p<0.01);重组乳酸菌pPG-OF-Co1-DCpep/M11和pPG-OF/M11相比,初次免疫后第4天,在免疫鸡粪便中检测到的黏膜抗体IgA水平,重组乳酸菌pPCG-OF-Co1-DCpep/M11免疫组高于pPG-OF/M11免疫组,且初次免后第7天,重组乳酸菌pPG-OF-Col-DCpep/M11诱导动物机体产生的黏膜抗体IgA和血清抗体IgG水平显著高于pPG-OF/M11免疫组(p<0.05),表明靶向M细胞和DC传递抗原的重组乳酸菌pPG-OF-Co1-DCpep/M11诱导机体产生免疫应答的能力优于pPG-OF/M11;攻菌保护结果显示,重组乳酸菌pPG-OF-Co1-DCpep/M11的免疫保护率为80%,重组乳酸菌pPG-OF/M11的免疫保护率为70%。综上所述,本研究构建的靶向M细胞和DC传递禽致病性大肠杆菌fimA和ompC抗原的重组乳酸菌pPG-OF-Co1-DCpep/M11作为口服免疫制剂具有良好的免疫原性,既能诱导局部黏膜免疫应答,又可刺激机体产生系统的体液免疫应答,且具有良好的免疫保护效果,为研制禽大肠杆菌病新型预防制剂提高了基础。