稀缺药用植物小蔓长春花产活性成分内生真菌的研究

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采用常规的真菌分离方法,从稀缺药用植物小蔓长春花中分离出了10株内生真菌,并以此为对象进行以下研究工作。根据生物碱类化合物所具有的颜色反应,初步筛选出1株可能产生生物碱类化合物的菌株XM J2。通过TLC条件的筛选,选用异丙醚-二甲苯-丙酮-甲醇(2∶2∶1∶0.2)作为展开剂,用改良碘化铋钾作为显色剂,进一步检测XM J2产生生物碱的能力,并利用Rf值初步定性。结果表明XM-J2的代谢物与长春胺标准品在同一色谱条件下具有相同的Rf值。扩大培养XM-J2,提取菌株的代谢物,利用硅胶柱层析精制,洗脱剂为50%甲醇,洗脱液在长春胺特征吸收波长λ=269nm下进行检测。收集在此波长下吸光度较大的洗脱液,挥干溶剂后得到XM-J2代谢物精制样品。利用HPLC对比精制样品和长春胺标准品保留时间,并检测样品纯度,在保证样品纯度大于90%的基础上利用结构确证常用方法,通过红外、紫外、1H-NMR、H-HCOSY谱图考察样品与目标化合物长春胺分子结构的相似程度。实验结果表明:柱层析后的精制样品中存在与长春胺标准品保留时间相一致的物质峰;提取物的紫外、红外谱图与文献报道的长春胺标准品谱图一致;1H-NMR谱图解析后得到的分子氢骨架与长春胺分子结构相一致,综合以上可以确定XM-J2菌株代谢物中存在长春胺物质。通过对不同固体培养基中菌落的生长速率和长势进行比较,发现在马铃薯蔗糖培养基上该菌生长较快。通过对不同液体培养基中XM-J2的生物量和长春胺产生量的列比,筛选出适合XM-J2菌丝生长及产物长春胺合成的马铃薯蔗糖液体培养基。在该培养基中,当菌株发酵液中菌丝体干重最大时长春胺产率为0.64 mg·L-1。单因素分析实验初步确定实验室发酵XM-J2菌株的最佳碳源、氮源和温度分别是蔗糖、蛋白胨和28℃。通过正交实验优化XM-J2的发酵条件,得出适宜菌丝生长且利于代谢物积累的发酵条件培养基配比为蔗糖50g·L-1,蛋白胨1g.L-1.装量为85~90ml/250ml,PH7.0左右,培养温度28℃,转速80r/min。根据XM-J2菌株的显微结构特征,对XM-J2菌株进行了分类,初步确定为:真菌门,半知菌类,丝孢纲,无孢目。
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