论文部分内容阅读
本论文利用异核多维核磁共振方法对金黄色葡萄球菌核酸酶(SNaseV8)的突变体和片段进行了研究。第一章为核磁共振基本原理的简要综述;第二章为蛋白质核磁共振技术的简要综述;第三章至第五章分别为各个突变体和片段的研究结果。
1.金黄色葡萄球菌核酸酶全部脯氨酸突变体(V8PF)的溶液结构及骨架动态特性研究
金黄色葡萄球菌核酸酶是一个很好的研究蛋白质的折叠,动态特性以及结构功能关系的模型蛋白。在野生型的金黄色葡萄球菌核酸酶中含有6个脯氨酸,脯肽键的顺反异构化对蛋白质的结构、动态特性及功能都有着重要的影响。对V8PF酶活的研究结果表明其酶活力只有SNaseV8的1.4%。为了研究脯氨酸突变影响酶活的机制,我们利用异核多维核磁共振方法结合J耦合共振指认策略对V8PF主链和侧链进行了几乎完全的共振指认。由核磁共振实验所得的距离约束和二面角约束计算了V8PF的溶液三维结构。测定了V8PF骨架15N的R1、R2和1H-15NNOE,并利用Modelfree方法进行了分析。结果表明酶活的变化主要受Proll7和Pro47突变的影响。其中Proll7的突变改变了活性部位附近肽段的构象,Pro47的突变则使得Ω-loop的动态特性发生了很大的变化,正是因为这些变化使得V8PF的酶活大大降低。
2.金黄色葡萄球菌核酸酶β亚结构域片段SNase(1-121)和α亚结构域片段SNase(110-143)互补研究
对核酸酶N端大片段折叠的研究表明,α亚结构域肽段对β桶结构的稳定有重要的作用。为了进一步研究α亚结构域肽段稳定β桶结构的机制,我们研究了SNase(1-121)片段与SNase(110-143)片段的互补作用。酶活研究结果表明当SNase(1-121)片段与SNase(110-143)片段形成互补复合物后,SNase(1-121)片段的酶活有显著的提高。利用异核多维核磁共振方法研究了复合物中SNase(1-121)片段的三维结构和骨架动态特性。结果表明在复合物中SNase(1-121)片段形成了很好的类天然态构象。利用界面实验确定了SNase(1-121)片段中参与结合的相关残基。结果表明SNase的第三个α螺旋对β桶的稳定有重要的作用。
3.金黄色葡萄球菌核酸酶Ca2+结合位点突变体(V8PM)与DNA相互作用研究
核酸酶催化核酸水解的反应机制是基于核酸酶的三元复合物Ca2++pdTp+SNase的晶体结构而提出的。由于SNase可以很迅速的水解DNA,所以有关SNase与DNA作用的研究尚未见报导。为了进一步研究SNase结合水解DNA的机制,我们构建了无酶活的突变体V8PM。利用异核多维核磁共振方法研究了其与DNA的相互作用。初步的结果表明V8PM与DNA以化学计量比1:1结合,DNA的结合部位包括活性部位和β桶表面的一部分。