胶质细胞瘤在颅内恶性肿瘤中无论是侵袭程度还是发病率都是位居首位的。虽然有先进的多学科治疗方法,如手术、化疗、放疗等,但高恶性程度胶质瘤对于患者仍然是致命的。尽管化疗方式有所进展,但恶性胶质瘤患者在术后的平均存活时间仍然少于15个月。替莫唑胺作为烷基化抗肿瘤药物已成为抗恶性胶质瘤的一线药物。但由于肿瘤细胞对药物的普遍耐药性,替莫唑胺治疗恶性胶质瘤的有效率不到45%。异甘草素有多靶点、多机制的抗肿瘤特性,尤其是抑制肿瘤生长及诱导细胞凋亡方面作用显著。本研究为异甘草素的抗瘤效应和机制进行了拓展,并为异甘草素在治疗人胶质瘤方面的应用提供了理论依据。目的:探讨异甘草素在诱导人胶质瘤细胞SHG44自噬、凋亡的作用及涉及的分子信号,观察异甘草素联合替莫唑胺对人胶质瘤细胞SHG44增殖、自噬、凋亡的影响,为异甘草素治疗人胶质瘤奠定理论依据。方法:1.异甘草素对人胶质瘤细胞SHG44增殖、自噬、凋亡的影响:应用异甘草素在不同时段、不同浓度下作用于人胶质瘤细胞SHG44,利用CCK-8法了解SHG44细胞增殖受抑制的情况;用流式细胞术Annexin V-IP标记来检测不同浓度异甘草素(0、20、40、60、80μmol/L)处理SHG44人胶质瘤细胞48h后细胞的凋亡情况;通过透射电镜观察人胶质瘤细胞SHG44内部超微结构发生的变化;应用免疫荧光染色观测细胞内部及其周边自噬和凋亡相关蛋白的分布情况;再应用Western blot检测细胞中Caspase-3、Bcl-2以及LC3B等蛋白的表达趋势。2.异甘草素联合替莫唑胺对人胶质瘤细胞SHG44增殖、自噬、凋亡的影响:通过体外实验,观察异甘草素单药、替莫唑胺单药以及异甘草素联合替莫唑胺对SHG44人胶质瘤细胞的作用结果。应用CCK-8法测试各组细胞增殖抑制率的差异;流式细胞术Annexin V-PI标记检测各组细胞的凋亡变化;通过透射电镜观测SHG44细胞在异甘草素和替莫唑胺联合作用后细胞超微结构的变化;应用免疫荧光染色观测细胞内部及其周边自噬和凋亡相关蛋白的分布情况;利用Western blot检测各组中细胞自噬、凋亡蛋白以及及相关分子信号的表达差异。结果:1.异甘草素作用于人胶质瘤细胞SHG44后,可见肿瘤细胞在增殖过程中呈现除时间及剂量依赖性的增殖抑制,且异甘草素80μmol/L组在作用72h后对SHG44细胞的抑制率超过了半数抑制率;流式细胞术检测出不同浓度异甘草素(0、20、40、60、80μmol/L)作用于SHG44人胶质瘤细胞48h后,细胞的凋亡率分别为(1.54±0.85)%、(6.72±2.81)%、(11.82±3.21)%、(16.61±3.79)%和(26.15±3.82)%;透射电镜下可见细胞内部出现自噬小泡以及自噬溶酶体;在荧光显微镜下可见SHG44细胞内出现的自噬以及凋亡相关的免疫荧光颗粒;Western blot结果显示异甘草素作用于SHG44细胞48h后LC3-Ⅱ/Ⅰ比值以及Caspase-3的蛋白表达均呈现上升趋势,而Bcl-2表达呈下降趋势。2.实验中人胶质瘤细胞SHG44对加药各组都具有剂量依赖性的增殖抑制,且与异甘草素、替莫唑胺单药组相比两者联合用药组对胶质瘤产生的增殖抑制率更为显著(P<0.05);流式细胞术检测单用替莫唑胺(200μmol/L)、异甘草素(80μmol/L)作用于胶质瘤细胞48h后,早期凋亡率分别为(12.62±3.12)%、(24.86±4.01)%,而联合组的凋亡率明显上升为(38.31±4.97)%;透射电镜下联合处理组的SHG44细胞中出现大量自噬体以及凋亡小体;异甘草素和替莫唑胺联合组在荧光显微镜下明显可见细胞内自噬及凋亡相关蛋白的荧光颗粒分布;Western blot检测中联合组较单药组在LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Caspase-3以及Beclin 1在蛋白表达水平上均升高,而Bc L-2呈下降趋势。结论:1.异甘草素能有效的抑制人胶质瘤细胞SHG44的增殖,诱导SHG44细胞发生自噬和凋亡,并且抑制了抗凋亡分子bcl-2的表达,增加了凋亡相关分子caspase-3和自噬相关分子LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的表达。2.异甘草素可以增强替莫唑胺对人胶质瘤细胞SHG44的生长抑制,其主要表现在两药联合效抑制了SHG44细胞的增殖,且诱导自噬和凋亡的发生。