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第一部分 WAS蛋白调控记忆T的形成与功能维持
背景：WAS综合征是一组以湿疹、血小板减少、继而出现反复感染、自身免疫和易患肿瘤为临床特征的X连锁原发性免疫缺陷病，通常女性携带，男性患病。现有研究结果已经证实 T 细胞功能缺陷是其免疫缺陷的核心原因。但WAS患儿在婴幼儿期的感染的频率与严重程度与正常同龄儿童相似，随着年龄的增长，WAS患儿逐渐出现明显不同于正常儿童的免疫应答缺陷，感染尤其是病毒感染成为大龄儿童最重要的死因之一。本研究应用病毒感染WAS基因敲除小鼠及同窝WT小鼠，进行了CD8+T细胞记忆相关的研究。
方法：对LCMV感染后不同时间点WAS KO及WT小鼠全血及脾脏细胞进行实验。运用四聚体技术检测两组小鼠抗原特异性CD8+T细胞的频率及随时间变化的曲线；利用体外抗原肽刺激两组小鼠脾脏细胞，对比两组抗原特异性CD8+T细胞因子的分泌；利用过继免疫后再次感染，比较两组记忆CD8+T细胞的再次扩增能力及保护性反应；利用嵌合小鼠，检测 WAS蛋白缺陷对 CD8+T 细胞记忆形成的影响是固有的还是内环境因素所致。
结果：1）WAS 小鼠高效的T细胞克隆扩增及效应T细胞分化。尽管在未感染状态下， WAS 小鼠 CD8+T 细胞频率显著降低，但在LCMV 病毒感染的扩增阶段（D3、D8），WAS小鼠 CD8+T 细胞能够高效的扩增，代偿起始 CD8+T 细胞的减少。两组 CD8+T 细胞频率及GP33 特异性 CD8+T 细胞频率比较无显著性差异。在 GP33 特异性CD8+T细胞中，两组的记忆前体细胞、TCM、TEM、T-bet、Ki67、BCL-2等表达无显著性差异。KO小鼠中IFN-r、CD107a、Granzyme B阳性细胞的频率较WT组显著升高。2）WAS小鼠GP33特异性CD8+T 细胞在收缩及记忆形成早期阶段部分受损。在LCMV感染后 D15、D30，两组抗原特异性CD8+T细胞的频率及绝对数量均无显著性差异。但在抗原特异性CD8+T细胞中，WAS小鼠TCM比例降低，CD127阳性记忆前体细胞比例显著降低，同时 CD95 阳性细胞比例显著升高，提示在记忆期抗原特异性CD8+T细胞数量受损。体外经GP33抗原肽刺激， IFN-r、TNF-a、CD107a、Granzyme B等阳性的细胞比例显著升高，提示WAS敲除小鼠CD8+T细胞难于维持静息的状态。3）WAS小鼠GP33特异性CD8+T细胞在记忆维持阶段降低，耗竭T增高。在LCMV感染后 D60、D100及以后时间点，WAS小鼠中GP33特异性CD8+T细胞比例降低，在LCMV感染后D200、D255，WAS小鼠抗原特异性CD8+T细胞比例及数量均明显降低，在上述各时间点，WAS小鼠的抗原特异性CD8+T细胞的TCM比例降低，CD127阳性细胞比例降低，耗竭T细胞比例显著增高。经 GP33 体外刺激，IFN-r、TNF-a、CD107a、Granzyme B等阳性的细胞比例仍持续升高。两组抗原特异性CD8+T细胞中，未刺激状态下，其Ki 67表达量无显著差异，BCL-2表达量KO组正常或稍降低。4）WAS小鼠胸腺CD8输出正常，抗原特异性CD8+T细胞通过外源性途径凋亡增多。WAS小鼠胸腺细胞、CD8单阳细胞数目，CD62L、CD69等胸腺成熟指标表达与WT小鼠比较无显著性差异。提示WAS小鼠胸腺CD8输出正常。在不同时间点，WAS小鼠中GP33特异性 CD8+T 细胞 BCL-2 的表达量较 WT 组比较稍降低或正常，但FAS、FASL表达量均较WT小鼠明显增高。且经GP33抗原肽体外刺激，WAS小鼠抗原特异性CD8+T细胞存活率较WT组明显降低，凋亡增加，这提示WAS小鼠抗原特异性CD8+T细胞通过FAS、FASL途径凋亡增多，是抗原特异性CD8+T细胞降低的原因之一。 5）WAS小鼠GP33特异性CD8+T细胞再次应答时扩增能力降低，保护性反应减弱。通过过继免疫，过继相同数量的GP33阳性CD8+T细胞到CD45.1小鼠，第二天尾静脉注射Lm-GP33细菌，5天后检测GP33阳性CD8+T细胞的扩增及小鼠Lm的载量。WT小鼠GP33特异性CD8+T细胞扩增能力显著强于KO小鼠，其脾脏、肝脏中Lm细菌的载量也显著低于KO小鼠。6）WAS蛋白内源性调控GP33特异性CD8+T细胞记忆的形成。嵌合后小鼠经LCMV感染，D60时，WAS小鼠抗原特异性CD8+T细胞比例显著降低，而细胞因子阳性的比例仍显著升高，重现了未嵌合状态下的结果，提示WAS蛋白缺陷对T细胞记忆的影响为内源性的。
结论：WAS小鼠的抗原特异性记忆CD8+T细胞明显减少，再次应答能力降低，保护性反应减弱，同时WAS小鼠的耗竭T增多，经抗原肽刺激产生的细胞因子增多。这解释了大龄WAS患儿感染频率较同龄儿童明显升高及自身免疫。这有助于加深我们对抗原特异性CD8+T细胞稳态维持的理解。有利于今后研发新的、有效的WAS治疗策略和疫苗策略。
第二部分 两例先天性中性粒细胞减少症患儿及其嵌合父亲粒细胞功能研究
背景：先天性中性粒细胞减少症是一组以致命性化脓性感染、牙龈炎、慢性牙周炎为特征的一组罕见病，其中约50%为ELANE基因突变所导致。目前为止，全球共报道突变位点超过200个，但仅报道有4个嵌合家系。嵌合父母无临床表现，但其粒细胞功能是否有缺陷，目前尚不清楚。本中心收取 2 例患儿，经验证两者的父亲均存在嵌合现象。本研究探索了ELANE基因突变除了影响粒细胞的数量，是否影响粒细胞的功能。
方法：分离外周血单个核淋巴细胞及中性粒细胞，进行一代测序及TA克隆；通过鲁米诺放大的化学发光法，检测粒细胞ROS产生情况；通过共聚焦显微镜，分析中性粒细胞弹力蛋白酶表达情况；对粒细胞进行蛋白质免疫印迹，检测其NADPH各组分表达情况。
结果：两例患儿均携带有致病性突变，其各自的父亲外周血粒细胞均未发现突变，但PBMC均存在突变。两例患儿外周血粒细胞经离子霉素刺激，其产生的内源性ROS明显受损，而两例患儿各自父亲粒细胞经离子霉素刺激，其产生的内源性ROS正常。两例患儿粒细胞中中性粒细胞弹力蛋白酶表达显著升高，其各自父亲粒细胞中性粒细胞弹力蛋白酶表达正常。患儿及父亲的 NADPH 组成成分 P22phox、P40phox、P47phox、P67phox、gp91phox 表达量均与正常人无显著差异。
结论：ELANE基因突变所致先天性中性粒细胞减少症其粒细胞数量减少，功能亦受到明显影响。嵌合现象在此病中并不少见，这为遗传咨询带来了一定难度，对嵌合机制的进一步深入研究，将会为疾病的治疗带来曙光。
背景：WAS综合征是一组以湿疹、血小板减少、继而出现反复感染、自身免疫和易患肿瘤为临床特征的X连锁原发性免疫缺陷病，通常女性携带，男性患病。现有研究结果已经证实 T 细胞功能缺陷是其免疫缺陷的核心原因。但WAS患儿在婴幼儿期的感染的频率与严重程度与正常同龄儿童相似，随着年龄的增长，WAS患儿逐渐出现明显不同于正常儿童的免疫应答缺陷，感染尤其是病毒感染成为大龄儿童最重要的死因之一。本研究应用病毒感染WAS基因敲除小鼠及同窝WT小鼠，进行了CD8+T细胞记忆相关的研究。
方法：对LCMV感染后不同时间点WAS KO及WT小鼠全血及脾脏细胞进行实验。运用四聚体技术检测两组小鼠抗原特异性CD8+T细胞的频率及随时间变化的曲线；利用体外抗原肽刺激两组小鼠脾脏细胞，对比两组抗原特异性CD8+T细胞因子的分泌；利用过继免疫后再次感染，比较两组记忆CD8+T细胞的再次扩增能力及保护性反应；利用嵌合小鼠，检测 WAS蛋白缺陷对 CD8+T 细胞记忆形成的影响是固有的还是内环境因素所致。
结果：1）WAS 小鼠高效的T细胞克隆扩增及效应T细胞分化。尽管在未感染状态下， WAS 小鼠 CD8+T 细胞频率显著降低，但在LCMV 病毒感染的扩增阶段（D3、D8），WAS小鼠 CD8+T 细胞能够高效的扩增，代偿起始 CD8+T 细胞的减少。两组 CD8+T 细胞频率及GP33 特异性 CD8+T 细胞频率比较无显著性差异。在 GP33 特异性CD8+T细胞中，两组的记忆前体细胞、TCM、TEM、T-bet、Ki67、BCL-2等表达无显著性差异。KO小鼠中IFN-r、CD107a、Granzyme B阳性细胞的频率较WT组显著升高。2）WAS小鼠GP33特异性CD8+T 细胞在收缩及记忆形成早期阶段部分受损。在LCMV感染后 D15、D30，两组抗原特异性CD8+T细胞的频率及绝对数量均无显著性差异。但在抗原特异性CD8+T细胞中，WAS小鼠TCM比例降低，CD127阳性记忆前体细胞比例显著降低，同时 CD95 阳性细胞比例显著升高，提示在记忆期抗原特异性CD8+T细胞数量受损。体外经GP33抗原肽刺激， IFN-r、TNF-a、CD107a、Granzyme B等阳性的细胞比例显著升高，提示WAS敲除小鼠CD8+T细胞难于维持静息的状态。3）WAS小鼠GP33特异性CD8+T细胞在记忆维持阶段降低，耗竭T增高。在LCMV感染后 D60、D100及以后时间点，WAS小鼠中GP33特异性CD8+T细胞比例降低，在LCMV感染后D200、D255，WAS小鼠抗原特异性CD8+T细胞比例及数量均明显降低，在上述各时间点，WAS小鼠的抗原特异性CD8+T细胞的TCM比例降低，CD127阳性细胞比例降低，耗竭T细胞比例显著增高。经 GP33 体外刺激，IFN-r、TNF-a、CD107a、Granzyme B等阳性的细胞比例仍持续升高。两组抗原特异性CD8+T细胞中，未刺激状态下，其Ki 67表达量无显著差异，BCL-2表达量KO组正常或稍降低。4）WAS小鼠胸腺CD8输出正常，抗原特异性CD8+T细胞通过外源性途径凋亡增多。WAS小鼠胸腺细胞、CD8单阳细胞数目，CD62L、CD69等胸腺成熟指标表达与WT小鼠比较无显著性差异。提示WAS小鼠胸腺CD8输出正常。在不同时间点，WAS小鼠中GP33特异性 CD8+T 细胞 BCL-2 的表达量较 WT 组比较稍降低或正常，但FAS、FASL表达量均较WT小鼠明显增高。且经GP33抗原肽体外刺激，WAS小鼠抗原特异性CD8+T细胞存活率较WT组明显降低，凋亡增加，这提示WAS小鼠抗原特异性CD8+T细胞通过FAS、FASL途径凋亡增多，是抗原特异性CD8+T细胞降低的原因之一。 5）WAS小鼠GP33特异性CD8+T细胞再次应答时扩增能力降低，保护性反应减弱。通过过继免疫，过继相同数量的GP33阳性CD8+T细胞到CD45.1小鼠，第二天尾静脉注射Lm-GP33细菌，5天后检测GP33阳性CD8+T细胞的扩增及小鼠Lm的载量。WT小鼠GP33特异性CD8+T细胞扩增能力显著强于KO小鼠，其脾脏、肝脏中Lm细菌的载量也显著低于KO小鼠。6）WAS蛋白内源性调控GP33特异性CD8+T细胞记忆的形成。嵌合后小鼠经LCMV感染，D60时，WAS小鼠抗原特异性CD8+T细胞比例显著降低，而细胞因子阳性的比例仍显著升高，重现了未嵌合状态下的结果，提示WAS蛋白缺陷对T细胞记忆的影响为内源性的。
结论：WAS小鼠的抗原特异性记忆CD8+T细胞明显减少，再次应答能力降低，保护性反应减弱，同时WAS小鼠的耗竭T增多，经抗原肽刺激产生的细胞因子增多。这解释了大龄WAS患儿感染频率较同龄儿童明显升高及自身免疫。这有助于加深我们对抗原特异性CD8+T细胞稳态维持的理解。有利于今后研发新的、有效的WAS治疗策略和疫苗策略。
第二部分 两例先天性中性粒细胞减少症患儿及其嵌合父亲粒细胞功能研究
背景：先天性中性粒细胞减少症是一组以致命性化脓性感染、牙龈炎、慢性牙周炎为特征的一组罕见病，其中约50%为ELANE基因突变所导致。目前为止，全球共报道突变位点超过200个，但仅报道有4个嵌合家系。嵌合父母无临床表现，但其粒细胞功能是否有缺陷，目前尚不清楚。本中心收取 2 例患儿，经验证两者的父亲均存在嵌合现象。本研究探索了ELANE基因突变除了影响粒细胞的数量，是否影响粒细胞的功能。
方法：分离外周血单个核淋巴细胞及中性粒细胞，进行一代测序及TA克隆；通过鲁米诺放大的化学发光法，检测粒细胞ROS产生情况；通过共聚焦显微镜，分析中性粒细胞弹力蛋白酶表达情况；对粒细胞进行蛋白质免疫印迹，检测其NADPH各组分表达情况。
结果：两例患儿均携带有致病性突变，其各自的父亲外周血粒细胞均未发现突变，但PBMC均存在突变。两例患儿外周血粒细胞经离子霉素刺激，其产生的内源性ROS明显受损，而两例患儿各自父亲粒细胞经离子霉素刺激，其产生的内源性ROS正常。两例患儿粒细胞中中性粒细胞弹力蛋白酶表达显著升高，其各自父亲粒细胞中性粒细胞弹力蛋白酶表达正常。患儿及父亲的 NADPH 组成成分 P22phox、P40phox、P47phox、P67phox、gp91phox 表达量均与正常人无显著差异。
结论：ELANE基因突变所致先天性中性粒细胞减少症其粒细胞数量减少，功能亦受到明显影响。嵌合现象在此病中并不少见，这为遗传咨询带来了一定难度，对嵌合机制的进一步深入研究，将会为疾病的治疗带来曙光。