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目的：应用分子生物学及免疫组化方法，研究皮瓣组织缺血再灌注(ischemia-reperfusion I/R)损伤不同时间点细胞凋亡及相关基因bcl-2表达的变化规律，探讨缺血再灌注损伤对皮瓣组织细胞凋亡及相关基因bcl-2表达的影响，为临床上减轻直至消除皮瓣组织缺血再灌注损伤、提高皮瓣移植成活率，从调控细胞凋亡角度开辟新的治疗途径。
方法：1、实验动物：雄性健康Wister大鼠40只，称重，编号。2、实验动物分组：将大鼠随机分为五组，即对照组(Ⅰ组)、再灌注2小时组(Ⅱ组)、再灌注6小时组(Ⅲ组)、再灌注12小时组(Ⅳ组)和再灌注24小时组(Ⅴ组)，每组8只。3、皮瓣制备方法：2％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉，每3小时追加一次(20mg/kg)以维持麻醉，大鼠仰卧，四肢固定，剪除腹毛，75％酒精消毒，按照PetryJJ等描述的方法，于右下腹设计一以腹壁浅血管为蒂的轴形皮瓣，大小为6cm×3cm。Ⅰ组：按上述方法制备皮瓣，皮瓣形成后原位缝合，不做其他处理：Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组：按上述方法制备皮瓣，皮瓣形成后，用微血管夹夹闭腹壁浅动脉发出点近端的股动脉，8小时后手术去除血管夹。4、取材：Ⅰ组在皮瓣形成后即刻于皮瓣中段边缘取全层皮瓣组织2cm×1cm；Ⅱ组于再灌注后2小时用同样方法取材；Ⅲ组于再灌注后6小时取材；Ⅳ组于再灌注后12小时取材；V组于再灌注后24小时取材。将所取组织一部分置于4％多聚甲醛溶液中固定，及时制成石蜡切片，待做免疫组化染色和细胞凋亡原位末端标记；将另一部分组织(约100mg)于-80℃冰箱保存，备Bcl-2 mRNA检测。5、检测方法及指标：(1)凋亡细胞原位末端标记(TUNEL法)与半定量分析：对皮瓣组织石蜡切片采用TUNEL法原位标记DNA片段检测凋亡细胞，操作方法严格按照说明书进行，光镜下观察凋亡细胞的分布，阳性细胞可见细胞核呈棕黄色。根据凋亡阳性细胞分布情况，每张切片于40倍目镜下随机拍摄5个阳性视野，每视野记数300个细胞中阳性细胞数，计数凋亡细胞数目及总细胞数目，以阳性细胞数所占总细胞数的百分比作为凋亡细胞阳性指数(AI，AI=凋亡细胞数目/总细胞数目×100％)。(2)逆转录-多聚酶链反应法(reverse transcription，RT-PCR)半定量检测Bcl-2 mRNA水平：依据文献报道设计引物，由上海生物工程公司合成。引物序列：Bcl-2上游引物：5’-CAAGAATGCAAAGCACATCC-3’，Bcl-2下游引物：5’-ATCCCAGCCTCCGTTATCC-3’。β-actin上游引物：5’-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3’，β-actin下游引物：5’-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3’。按Trizol RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，RNA保存在-80℃，用紫外分光光度吸收法测定RNA的含量。然后进行逆转录和PCR扩增反应，Bcl-2 mRNA的相对含量用β-actin条带灰度值标化后的Bcl-2条带灰度值表示。(3)免疫组化检测及评分：对石蜡切片进行SP法免疫组化染色，步骤严格按照试剂盒说明书进行，光镜下观察Bcl-2蛋白的分布和着色深浅程度，阳性与阴性对照同时进行，阳性信号以胞质或胞膜有棕黄色或棕褐色颗粒为判断。免疫组化评分(immunohistochemicalscores IHS)方法参照文献，结合阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱两个方面评分：a为阳性细胞百分比(无阳性细胞=0，阳性细胞占1-10％=1，11-50％=2，51-80％=3，81-100％=4)，b为阳性细胞染色强弱(阴性=0，弱阳性=1，中度阳性=2，强阳性=3)，a，b两项乘积即为该例组织的IHS。6、统计学处理：用SAS6.12统计学处理软件，对不同类型数据进行不同的统计学处理。
结果：1、TUNEL法观察细胞调亡情况：光镜下观察，TUNEL标记DAB染色的阳性细胞主要位于皮瓣组织的上皮基底层细胞、成纤维细胞、毛囊、汗腺、皮脂腺及血管壁细胞中，皮下结缔组织中也可见少量，染色主要位于胞核，呈棕黄色。其中Ⅰ组仅可见少量、散在的阳性细胞；Ⅱ组～Ⅴ组阳性细胞均较Ⅰ组明显增多，且Ⅱ组～Ⅴ组的TUNEL阳性细胞表达呈逐渐增强的趋势。Ⅰ～Ⅴ组的AI分别为：(17.32±0.97)％、 (24.51±1.64)％、 (30.69±2.14)％、(35.42±2.3 1)％和(39.95±2.47)％，Ⅱ组～Ⅴ组与Ⅰ组比较差异显著(P＜0.05)，且Ⅱ组～Ⅴ组的AI关系为：Ⅱ组＜Ⅲ组＜Ⅳ组＜Ⅴ组(P均＜0.05)。2、RT-PCR法测Bcl-2mRNA水平：PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳，UVP凝胶成像系统自动扫描，测各条带吸光度(A)，以目的基因A与β-actin A的比值代表目的基因的相对表达量，Ⅰ～Ⅴ组的Bcl-2相对表达量分别为：(0.177±0.011)、(0.293±0.023)、(0.389±0.027)、 (0.507±0.036)和(0.403±0.031)。Ⅱ组～Ⅳ组较Ⅰ组表达明显增强(P＜0.05)，Ⅱ组～Ⅳ组的表达关系为：Ⅱ组＜Ⅲ组＜Ⅳ组(P均＜0.05)：Ⅴ组较Ⅰ组表达明显增强(P＜0.05)，但与Ⅳ组比较，表达减弱(P＜0.05)。 3、免疫组化结果：光镜下观察，Bcl-2阳性细胞主要分布于皮瓣组织的上皮基底层细胞、成纤维细胞、毛囊、汗腺、皮脂腺及血管壁细胞中，与凋亡细胞的集中分布基本一致。染色主要位于胞浆，呈棕黄色或棕褐色。I～V组的Bcl-2阳性细胞IHS分别为：(1.34±0.12)、(4.73±0.25)、(7.19±0.48)、 (9.62±0.71)、 (7.33±0.5 1)。II组～V组较I组表达均明显增强(P＜0.05)，II组～Ⅳ组的表达关系为：II组＜III组＜IV组(P均＜0.05)，而V组较Ⅳ组表达则减弱(P＜0.05)。
结论：缺血再灌注损伤可诱导皮瓣组织细胞凋亡，同时，缺血再灌注损伤可使皮瓣组织中bcl-2表达增加，这说明调亡相关基因bcl-2参与缺血再灌注损伤机制，并为从基因角度调控皮瓣组织细胞凋亡提供理论依据。