MicroRNA-200a通过调控PDLIM1保护糖尿病视网膜病变中血管内皮细胞的功能

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前言
  糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病最常见的微血管并发症,是糖尿病人群主要致盲原因。随着人口结构及疾病谱的改变,糖尿病的发病率将持续增加,而DR目前仍是工作年龄阶段失明的主要原因。目前预防及治疗手段并不能避免所有的DR患者病情的进展,因此迫切需要更有效的治疗策略。血管内皮细胞是DR进展中的关键细胞,阐明影响血管内皮细胞功能的效应分子及致病通路将有助于开发新的治疗靶点。
  第一部分MiR-200a和PDLIM1在DR中表达
  目的
  验证房水、糖尿病视网膜病变DR患者视网膜前增殖膜及黄斑前膜标本和血清MiR-200a和PDLIM1含量与DR的病程进展的相关性。
  方法
  收集2019年1月到2020年1月就诊于本院的糖尿病患者(不伴有视网膜病变)、视网膜病变患者和特发性黄斑前膜(IERM)患者各30例(共90例),即DM组、DR组和IERM对照组。采集PDR患者和IERM患者空腹时的血清样本,于术中收集房水、DR患者视网膜前增殖膜或黄斑前膜样本,分别检测这些样本MiR-200a、PDLIM1和炎症因子表达以及房水中凋亡因子Bax、Bcl2、Caspase3的表达情况。两组之间数据比较采用独立样本t检验,两组以上的数据采用单因素方差分析进行比较。
  结果
  DR组DR患者视网膜前增殖膜中MiR-200a显著低于IERM组黄斑前膜样本,而其中PDLIM1表达显著高于IERM组(P<0.05)。DM组和DR组血清中MiR-200a和PDLIM1均显著低于IERM对照组(P<0.05),DM组与DR组比较无明显差异(P>0.05)。在局部及循环中,MiR-200a与PDLIM1含量负相关性。IL-1β、TNF-α、IL-6和ICAM1因子表达具有一致性,DM组和DR组均显著高于对照组,DM组与DR组之间比较无差异。房水中促凋亡因子Bax、caspase1的表达在DM,
  DR组均组高于对照组,DR组显著高于DM组(P<0.05),房水中抑制凋亡因子Bcl2在DM,DR组均组低于对照组(P<0.05),DR组显著低于DM组。
  结论
  1.MiR-200a、PDLIM1在DR患者DR患者视网膜前增殖膜和血清中表达异常,二者含量负性相关,可能与DR进展相关。
  2.DR患者血清中促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6和ICAM1表达升高,可能参与DR病程的进展。
  3.DR患者血清中凋亡相关指标Bax、Bcl2、Caspase3高表达,参与了DR的发展。
  第二部分MiR-200a通过PDLIM1缓解高糖诱导的HRMECS炎症及渗透性
  目的
  进行体外细胞实验,观察MiR-200a和PDLIM1在高糖环境下选用人视网膜微血管内皮细胞(HRMECS)细胞中的表达,以及对细胞活性、凋亡和迁移,以及氧化应激炎症因子的影响。
  方法
  选用HRMECS为实验细胞,设置Control、HG组检测MiR-200a及PDLIM1在高糖培养细胞模型中表达,设置Control、HG、HG+MiR-NC、HG+MiR-200a组共4组进行研究,构建野生型和突变型PDLIM1质粒,采用双荧光素酶报告分析MiR-200a靶基因,设置对照组(Control)、NG+MiR-NC、NG+MiR-200a组,高糖组(HG)、HG+MiR-NC、HG+MiR-200a组共6组。各组分别换入不同糖浓度(0mmol/L,0mmol/L,0mmol/L,35mmol/L,35mmol/L,35mmol/L)的内皮细胞培养基培养24h,构建高糖细胞模型,设计并转染MiR-200a、MiR-NC、PDLIM1质粒,采用MTT检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,蛋白质免疫印迹检测凋亡蛋白Bax、Bcl2、Caspase3表达,ELISA检测玻璃体中炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6和ICAM1表达。两组之间数据比较采用独立样本t检验,两组以上的数据采用单因素方差分析进行比较。
  结果
  MiR-200a及PDLIM1在高糖培养细胞模型中均有表达,且随着高糖处理细胞的时间增长,MiR-200a表达降低,PDLIM1表达增强。野生组MiR-200a+PDLIM1共转染组较MiR-NC+PDLIM1共转染组的荧光素酶活性显著降低(P<0.05),经PDLIM1处理的细胞HG组较对照组活性变化不明显,凋亡率、迁徙率增加、ROS和炎症因子表达增加(P<0.05);经MiR-200a处理的细胞HG+MiR-NC较HG组细胞活性增加,凋亡率、迁徙率降低,ROS和炎症因子表达降低(P<0.05)。
  结论
  1.高糖环境下HRMECS中MiR-200a表达降低及PDLIM1表达增加。
  2.PDLIM1是MiR-200a的靶基因,MiR-200a在DR进程中调控PDLIM1影响DR。
  3.MiR-200a可抑制高糖环境下HRMECS细胞的凋亡和迁移性,提高细胞活力,抑制氧化应激反应标志物ROS和炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1的分泌作用。
  第三部分MiR-200a通过下调PDLIM1影响DR进程
  目的
  进行小鼠模型体内实验,观察MiR-200a和PDLIM1在糖尿病小鼠视网膜中的表达以及对高糖环境下小鼠视网膜厚度和渗透性、典型炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6和ICAM1的影响。
  方法
  选择7~8周年龄C57BL/6J雄性小鼠,采用腹腔注射STZ方法构建1型糖尿病小鼠模型,检测血糖体重检测,RT-PCR检测2,4个月时DR小鼠玻璃体及视网膜样本的MiR-200a及PDLIM1含量。免疫组化法分析DR小鼠视网膜样本的PDLIM1定位及含量。设置对照组(Control),高糖组(DM),DM+PDLIM1组,DM+MiR-200a组,DM+PDLIM1+MiR-200a组,DM+PDLIM1+MiR-NC组,分别玻璃体内注射转染MiR-200aMiR-NC和PDLIM1的质粒1μl,采用OCT检测视网膜厚度,Evans蓝检测视网膜血管渗透性,ELISA检测玻璃体中炎症因子。两组之间数据比较采用独立样本t检验,两组以上的数据采用单因素方差分析进行比较。
  结果
  糖尿病小鼠视网膜病变模型,在不同时间点检测MiR-200a和PDLIM1的表达水平,注射ST
  Z后2个月和4个月MiR-200a表达均降低,而在2个月和4个月的PDLIM1表达显著增加(P<0.05);PDLIM1在小鼠视网膜中含量随糖尿病病程增加而上调,而在对照组未见明显PDLIM1表达。PDLIM1干预DM小鼠导致视网膜厚度、通透性、炎症因子表达均增加,PDLIM1+MiR-200a组较单纯PDLIM1干预DM组导致视网膜厚度、通透性、炎症因子表达明显降低(P<0.05),因此PDLIM1治疗可显著促进DR进展,MiR-200a注射可改善这种效果。
  结论
  1.随着DM病程增加,MiR-200a在糖尿病大鼠视网膜中表达降低,PDLIM1在DR中表达增加。
  2.PDLIM1可导致DM小鼠视网膜厚度增加,视网膜渗透上调,促进DR病程发展,MiR-200a可抑制PDLIM1对糖尿病小鼠视网膜的影响,降低视网膜厚度,降低渗透率,延缓DR病程发展。
  3.PDLIM1可增加糖尿病小鼠视网膜组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1含量,促进DR病程发展,MiR-200a可抑制PDLIM1对糖尿病小鼠视网膜的炎症因子的影响,降低炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1的表达,延缓DR病程发展。
  第四部分PDLIM1通过调控Wnt信号通路参与DR进展
  目的
  进行体外细胞实验,验证PDLIM1对以及Wnt信号通路关键蛋白及下游基因的影响,在影响DR病程和炎症中发挥的作用。
  方法
  选用HRMECS为实验细胞,设置对照组(Control)、PDLIM1过表达组(PDLIM1)、PDLIM1敲低组(siPDLIM1)及阴性病毒组(si Control)共4组。各组分别在35mmol/L高糖内皮细胞培养基EGM培养24h检测Wnt信号通路中E-Cadherin、β-catenin蛋白以及下游基因cyclinD1,c-myc及Cox-2表达。设置对照组(Control)、NG+MiR-NC、NG+siβ-catenin组,高糖组(HG)、HG+MiR-NC、HG+siβ-catenin组共6组。各组分别换入不同糖浓度(0mmol/L,0mmol/L, 0mmol/L,35mmol/L,35mmol/L,35mmol/L)的内皮细胞培养基培养24h,构建高糖细胞模型,设计并转染siβ-catenin、MiR-NCPDLIM1质粒,采用MTT检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,检测ROS含量,ELISA检测玻璃体中炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6和ICAM1表达。两组之间数据比较采用独立样本t检验,两组以上的数据采用单因素方差分析进行比较。
  结果
  PDLIM1组E-Cadherin、β-catenin蛋白以及下游基因cyclinD1,c-myc及Cox-2表达增强,siPDLIM1组E-Cadherin、β-catenin蛋白以及下游基因cyclinD1,c-myc及Cox-2表达降低(P<0.05)。抑制wnt通路中β-catenin蛋白可增加高糖环境下HRMECS细胞的活性,降低凋亡率和ROS及炎症因子表达,抑制PDLIM1对细胞的发挥作用。
  结论
  1.PDLIM1影响DR进程中利用了Wnt信号通路,可降低Wnt信号通路下游基因的表达。
  2.抑制Wnt信号通路可以抑制PDLIM1对HRMECS细胞活性及炎症因子的影响。
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研究背景  宫颈癌(cervical cancer)是全球女性恶性肿瘤中的第四大常见肿瘤,其详细的发病机制尚未明确,尽管人乳头状瘤病毒(high risk Human Papillomavirus, hr-HPV)的持续感染被认为是宫颈癌发生的高危因素,但除病毒感染外还存在着复杂的致病机制,因此准确了解宫颈癌的发生,发展及预后治疗的生物学功能和分子机制至关重要。目前尚未找到特异性和高敏感性的筛查标
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