黄单胞菌是一类重要的革兰氏阴性植物病原细菌,能产生一种称为菌黄素的黄色色素。菌黄素的生物合成主要是由pig基因簇负责完成,其中的xanB2基因参与产生一种扩散因子DF（diffusible factor）用于调控菌黄素生物合成。我们前期结果表明:DF是3-羟基苯甲酸（3-hydroxybenzoate,3-HBA）,其参与菌黄素的生物合成。本研究以野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris pv.campestris,简称Xcc）为模式菌株,主要对XanB2的催化机制及其催化反应产物3-HBA和4-羟基苯甲酸（4-hydroxybenzoate,4-HBA）的代谢机理展开研究。对xanB2基因敲除和过表达菌株进行分析,结果显示Xcc可通过XanB2产生3-HBA和4-HBA两种代谢产物。体外XanB2蛋白与分支酸共孵育结果也证实XanB2是一种独特的分支酸裂解酶,可催化底物分支酸裂解生成3-HBA和4-HBA。进一步的外源化合物添加试验表明:3-HBA主要参与菌黄素生物合成,4-HBA则主要负责呼吸链辅酶Q8的合成。点突变和功能域分析显示XanB2包含3个功能域。其中,氮末端区域I影响4-HBA的生成,碳末端区域III影响3-HBA的生成,中间区域II则对两者皆有影响。因此,XanB2是连接上游分支酸形成的莽草酸途径与下游菌黄素和辅酶Q合成途径的关键酶。将Xcc接种至外源添加4-HBA或3-HBA的基础培养基中进行培养,该菌仅可降解4-HBA。生物信息学发现Xcc含有一个4-HBA降解基因簇。其中,XCC0356基因编码4-羟基苯甲酸3-单加氧酶催化4-HBA形成原儿茶酸（Protocatechuate,PCA）。敲除该基因会阻碍Xcc对4-HBA的降解,但并不影响Xcc对PCA的降解。缺失XCC0356基因可造成Xcc对植物寄主的致病性有所下降。转录水平测试亦发现该基因仅响应于4-HBA的诱导,对PCA则无响应。PCA的邻位开环降解途径由XCC0364至XCC0371基因所编码的降解酶来完成。对其中关键基因进行分析发现:XCC0364和XCC0365共同编码了一个较为独特的β-酮己二酸琥珀酰CoA转移酶;XCC0367和XCC0368则共同编码了一个原儿茶酸3,4-双加氧酶。转录分析结果表明上述4个基因均响应于4-HBA和PCA的诱导。其相关基因缺失突变体菌株对植物寄主的致病性亦有所下降。此外,结合生物信息学分析及敲除回补试验推测XCC0355和XCC0373基因编码的蛋白可作为正调控因子参与4-HBA的降解。通过比较基因组学及相应分子生物学试验,我们发现Xcc中存在两个与3-HBA和4-HBA外排相关的转运体,分别是四组分的XCC4168-XCC4171和三组分的XCC1398-XCC1400。在外源添加2 mM 3-HBA或1.5 mM 4-HBA的培养体系中,敲除转运体XCC4168-XCC4171显著影响Xcc的生长,而敲除转运体XCC1398-XCC1400后,Xcc生长则无明显变化。对两者进行双敲除试验,结果表明上述两套转运体存在协同作用,但前者对3-HBA和4-HBA的敏感性远高于后者。除了3-HBA和4-HBA,两套转运体对镰刀菌酸、水杨酸、苯甲酸等化合物也存在一定程度的敏感。对两者进行致病性分析结果显示其相关缺失突变体菌株对植物寄主的致病菌均有所下降。另外,依据生物信息学分析及转录水平的试验数据,我们推测Xcc中可能包含两个参与3-HBA和4-HBA摄取的转运蛋白。除上述研究外,鉴于目前菌黄素的合成机制研究仅集中于pig基因簇中的xanB2基因,为今后更好地理解该色素合成机理,在此我们对该基因簇中其他基因亦进行了初步分析。通过逐个敲除菌黄素合成基因簇所含基因并对所得突变体的色素及3-HBA和4-HBA产量进行分析发现:除XanB2以外,受测的18株单基因敲除突变体株中还存在13株突变体的色素表型受影响,9株突变体的3-HBA和4-HBA的含量与野生型菌株相比存在差异。此外,我们还发现上述突变体菌株对植物寄主的致病性均呈现不同程度的下降。综合上述研究结果,我们较为全面系统地勾画出了Xcc中3-HBA和4-HBA在合成、降解及转运方面的网络框架,同时初步分析了菌黄素合成基因簇中相关基因的功能,为该菌在应对外界环境变化及其黄色素合成相关机理方面的进一步研究奠定了重要的理论基础。