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该论文内容主要包括文献综述与动物实验两部分组成。一、文献综述文献综述分为两部分,综述一主要从现代医学对COPD血管重塑的相关研究进展进行综述,包括COPD血管重塑病变的病理特征、发病影响因素与形成机制、与气道重构的关系、治疗及预后;综述二主要阐述了“微型癥瘕痹阻肺络”的病机假说,并详细介绍了该病机的络病学说及癥瘕理论依据。二、动物实验1.研究目的通过建立COPD大鼠模型,观察血管重塑情况,以大鼠肺血管病理变化为COPD血管重塑大鼠模型评价标准。观察不同剂量益气活血消癥方干预COPD模型大鼠血管重塑的疗效,即血管周围炎症浸润与血管形态学变化;通过对血清中血管重塑相关因子VEGF、ET-1、CTGF及TLR4/NF-κ B信号通路中的TLR4蛋白和NF-κ B/p65蛋白表达水平测定,研究益气活血消癥方对COPD炎症及血管重塑病变的干预作用,探讨益气活血消癥方对COPD血管重塑的作用及机制。从分子生物学角度探究益气活血消癥方对COPD血管重塑的干预作用,证实中医肺络微型癥瘕理论的合理性,为益气活血消癥方治疗COPD血管重塑病变提供可靠的实验依据,验证“微型癥瘕痹阻肺络”是COPD的病机本质,阐释内生“微型癥瘕”痹阻肺血络是COPD血管重塑的病理状态,达到丰富肺系理论,并期待能够为中医药临床干预COPD血管重塑及指导相关的基础研究提供借鉴。2.研究方法实验动物选用SPF级健康雄性Wistar大鼠60只,体重180～200g,鼠龄为8周,随机分组为6组,每组10只,即:空白组、模型组、西药组、益气活血消癥方低剂量组、中剂量组及高剂量组。实验采用香烟熏烟联合气道注入脂多糖(LPS)方法制备COPD大鼠模型,分别于实验的第7、14、21、28天对模型组、西药组、益气活血消癥方低剂量组、中剂量组及高剂量组气道内注入脂多糖200ug(1g/L),除注入LPS日外连续熏香烟12周(大鼠置于100cm×100cm×50cm自制有机玻璃熏烟箱中,每日熏烟2次,每次12支,每次30min,持续熏烟12周)。实验第4天起,模型组大鼠按10mg/kg·d给予生理盐水灌胃,连续12周;西药组大鼠雾化吸入布地奈德混悬液(剂量按体表面积换算为成人量的6.17倍),1次/日,连续12周;低剂量组按约合生药17.89g/kg·d,给予益气活血消癥方灌胃,低剂量:中剂量:高剂量组比值为1:2:3,即中剂量组约合35.78g/kg· d、高剂量组约合53.67g/kg· d,分别灌胃给药,共12周。空白组隔离喂养。实验12周后取材。取材前大鼠禁食水,用2%的水合氯醛(75mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后,以仰卧位固定在鼠板上,沿正中线剪开皮肤和腹壁肌肉,暴露腹主动脉并取血。将采血管置于离心机,4℃,3000r/min,离心10min,离心后取得上清液,置于-20℃冰箱保存以备酶联免疫吸附法(ELISA)指标检测;迅速开胸分离出肺组织,用4℃生理盐水漂洗干净,取右肺组织,浸入4%多聚甲醛中固定进行常规石蜡包埋、切片,用于HE染色。用光镜及电镜下观察肺血管结构改变,采用图像分析系统Image pro-plus6.0对各组均取直径100～300um与呼吸性细支气管或肺泡伴行的肺小动脉5支,观察肺小动脉直径、管壁厚度、管壁面积及血管总面积,计算出血管管壁/血管直径及各组管壁面积/血管总血管面积的百分比,反映肺小动脉血管壁增厚程度,并进行数据分析。用ELISA检测VEGF、ET-1、CTGF。采用免疫组化检测方法检测TLR4和NF-κB/p65蛋白的表达水平。数据采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析,评估益气活血消癥方对COPD血管重塑的干预作用及组间差异。3研究结果3.1大鼠的一般情况比较实验过程中空白组大鼠无死亡,西药组、模型组及益气活血消癥方中剂量组分别大鼠死亡3只,益气活血消癥方低剂量组、益气活血消癥高剂量组分别死亡2只;空白组大鼠活泼好动,反应灵敏,毛发光泽,食欲佳,体质量逐渐增加,无咳嗽,口鼻未见分泌物。模型组大鼠活动减少,行动缓慢,反应迟钝,摄食、饮水减少,体质量增长缓慢,毛色枯黄少光泽,撮毛,口鼻可见分泌物,咳嗽频频,偶可闻及气道痰鸣音,大便不成形。西药组、益气活血消癥方低剂量组、中剂量组及高剂量组大鼠症状介于空白组和模型组之间。模型组、西药组、益气活血消癥方低剂量组、中剂量组及高剂量组的大鼠在香烟烟熏10min后均可见烦躁不安,易激惹,前肢挠鼻,点头运动,呼吸频率加快,口唇发紫,可见鼻腔分泌物。中药高剂量组大鼠大便较稀软,其他各组大鼠便质正常,中药高剂量组大鼠进食饮水较少,其余各组进食饮水正常。3.2益气活血消癥方对COPD血管重塑大鼠模型血管平滑肌增生的影响3.2.1各组COPD模型大鼠肺血管病理图比较空白组肺血管壁菲薄,形态均匀,结构正常。模型组血管可见炎症细胞浸润,主要以淋巴细胞为主,血管平滑肌增生、血管壁明显增厚,管壁增厚形态不均匀,管腔狭窄,气腔扩大,部分肺泡间隔断裂、融合形成肺大泡。西药组、中药低剂量组、中剂量组及高剂量组介于空白组与模型组之间,可见血管平缓肌增生、肺血管壁增厚、管腔狭窄,但与模型组比较,可见血管平缓肌增生、管壁增厚、管腔狭窄均较减轻,尤其高剂量组中药干预后病理结果明显。3.2.2各组大鼠血管形态的测定用Image pro-plus6.0测量各组大鼠血管形态改变情况,模型组大鼠血管管壁/血管直径及各组管壁面积/血管总血管面积的百分比明显高于空白组,西药组、中药中、高剂量组可降低血管管壁/血管直径及各组管壁面积/血管总血管面积的百分比数值。表明益气活血消癥方在改善血管形态、抑制管壁增厚方面有着显著的效果,但是存在量效差异,中药低剂量组对血管形态改善效果不明显。3.2.3大鼠血清因子的检测ELISA法检测各组大鼠血清,检测结果显示:与空白组相比,余各组大鼠血清VEGF、ET-1和CTGF含量均增高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,西药组大鼠血清VEGF、ET-1含量表达下降,差异有统计学意义(P<0.01),各中药组表达水平明显均有下降趋势,差异有统计学意义(P<0.01);与西药组比较,益气活血消癥方低剂量组大鼠血清ET-1、CTGF含量下降,中剂量组及表达均降低,差异有统计学意义(P<0.05);与益气活血消癥方高剂量组比较,余各治疗组差异均具有统计学意义(P<0.05)。实验结果表明益气活血消癥方能够通过降低VEGF、ET-1、CTGF表达水平,干预COPD血管重塑,其中以益气活血消癥方高剂量效果更为显著。3.2.4益气活血消癥方对COPD大鼠TLR4/NF-κ B信号通路的影响用免疫组化检测方法检测COPD大鼠肺血管TLR4蛋白及NF-κ B蛋白含量表达水平。实验结果显示:空白组大鼠TLR4蛋白及NF-κB蛋白含量水平表达最低,模型组TLR4蛋白及NF-κB蛋白阳性表达最高,西药组、低剂量组、中剂量组及高剂量组介于两者之间,其中高剂量组TLR4蛋白及NF-κ B蛋白阳性表达较低。4研究结论①益气活血消癥方可以改善COPD大鼠模型血管形态情况,以干预COPD血管重塑病变。②益气活血消癥方可能通过干预TLR4/NF-κB信号通路的表达,以达到减低炎症反应,下调VEGF、ET-1、CTGF水平表达,从而发挥对COPD血管重塑病变的干预作用。③益气活血消癥方对TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达及血清因子VEGF、ET-1、CTGF水平表达调控,存在量效差异,其中益气活血消癥方高剂量组干预效果最佳。④益气活血消癥方基于“微型癥瘕痹阻肺络”病机假说为拟方,通过益气活血消癥方对COPD血管重塑实验效果,说明了“微型癥瘕”痹阻肺血络是COPD血管重塑病机的合理性,从而验证了“微型癥瘕痹阻肺络”是COPD的病机本质。