赤霉素(Gibberellin,GA)能调控砂梨的坐果、茎和叶的伸长及果实和种子发育等生理过程。在果树生产上,GA常用来提高果实产量和品质。为了更好的从转录组学和蛋白质组学层面解析GA促进果实发育的分子机制,以6年生砂梨品种cv.‘翠冠’为试验材料,在盛花后30天用GA(30mg.L-1)处理,分别采集果实膨大早期、中期和成熟期的样品进行比较转录组学和比较蛋白质组学分析。1.通过深度测序技术,de novo拼接获得砂梨的参考转录序列,用于获得Unigenes和发掘分子标记。组装获得37649条Unigenes,鉴定到4121个选择性剪切位点,30560个单碱基突变(SNP)位点和7443个简单重复序列(SSR)标记位点。通过BLAST2GO软件从Nr、GO、COG和KEGG对拼接获得的Unigene进行功能注释和分类,分别获得28550、17766、3682和10451条Unigene注释信息。同时检测到共117条Unigenes参与植物激素信号转导通路,132条Unigenes参与到碳水化合物的跨膜运输通路。2.通过构建数字基因表达谱(DGE)文库,寻找GA增强砂梨果实库强的关键靶点基因。以de novo拼接获得砂梨转录组序列为参考数据库,对果实膨大早期、中期和成熟期响应GA处理的显著差异表达的基因进行数字基因表达谱分析。对显著性差异的基因进行GO和代谢通路的富集分析。结果表明,DGE文库构建果实膨大前期、果实膨大中期和成熟期分别获得36953467,29792878和31149878个表达序列标签。GA处理与对照之间,果肉和果芯组织在膨大前期、果实膨大中期和成熟期差异表达的基因个数分别是678、32、24条和56、84、235条。差异表达的基因主要参与碳水化合物代谢、植物激素代谢、转运过程、植物激素信号转导等。生物信息学分析发现GA处理增加了细胞壁合成基因并且增强了糖转运、淀粉-蔗糖合成等;差异基因的荧光定量验证结果与RNA-seq的结果得到相互印证。GA通过对细胞骨架和光合同化物的跨膜运输基因表达的瞬时调控,以及调控植物激素水平和细胞分裂等过程,在促进果实膨大过程中发挥重要的作用。上述研究结果表明GA通过调控物质运转和代谢途径关键酶基因增强了梨果实库强?3.通过比较蛋白质组学检测鉴定到GA处理与未处理的果肉及果芯样品中显著性差异蛋白点115个,其中,64个蛋白点通过MALDI-TOF MS技术得到鉴定。GA处理后表达上调的蛋白质点涉及初级代谢产物合成、运输、离子通道和逆境应答等。在果实膨大期蛋白质丰度降低的功能涉及光呼吸、表观遗传学修饰和糖酵解等过程。通过荧光定量PCR技术验证17个和果实库强相关的差异蛋白质点。通过组织化学方法鉴定,发现GA处理后在果实膨大期出现H2O2含量增加,这可能是GA促进细胞壁松弛和果实成熟的诱因之一。用透射电子显微镜(TEM)对果肉细胞壁的观测结果也支持GA促进果实膨大的推论。质子泵、Rubis CO、丝氨酸羟甲基转移酶和甲酸脱氢酶基因蛋白丰度上调有利于库器官己糖积累。此外,膜联蛋白、蛋白酶体和腺苷酸均参与了细胞膨大过程。本研究GA处理为增强砂梨果实库活力和库容提供可靠的实验依据。初步构建了GA促进果实膨大的动态调控网络,扩展了对GA促进库强和果实发育的认识。4.Fruit weight 2.2(fw2.2)是一种通过负调控细胞分裂来影响果实大小主效QTL基因。本研究以de novo拼接获得的砂梨转录组数据库为基础,通过RACE技术,从砂梨中克隆获得fw2.2家族的c DNA全长序列,命名为Ppfw2.2。Ppfw2.2基因c DNA全长为812 bp,5′UTR和3′UTR分别为144 bp和41 bp,编码208个氨基酸残基的开放阅读框,预测的蛋白质分子量为23.08 k D。Ppfw2.2蛋白与蔷薇科苹果的亲缘关系最近。在烟草中进行亚细胞定位结果表明,Ppfw2.2基因产物定位在细胞膜上,具有跨膜结构和富半胱氨酸蛋白(Cysteine rich Protein)的保守结构域。通过q RT-PCR检测Ppfw2.2在转录水平受GA调控的影响,结果证实GA负调控Ppfw2.2的表达与DGEseq的检测结果一致。5.为了研究GA对砂梨果实库强的影响,研究了GA处理下3个不同发育时期果肉和果芯中果糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇及可溶性总糖含量变化,并进一步分析GA对山梨糖醇和蔗糖代谢关键酶基因表达的影响。研究结果表明,6-磷酸山梨糖醇脱氢酶基因(S6PDH)表达量前期较低,随着果实膨大逐渐升高,并且GA促进S6PDH在果实膨大中后期的表达;山梨糖醇代谢关键酶NAD-山梨糖醇脱氢酶基因(NAD-SDH)在果实膨大前期相对表达量很高,GA抑制了果实膨大前期NAD-SDH的表达。在蔗糖代谢中,酸性转化酶基因(SI)的表达量随着果实的膨大逐渐上升,在膨大中期达到高峰,然后开始下降,且果肉中SI表达量较果芯中的高。果芯中蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)表达量随着果实成熟而持续增加,果芯中表达水平较高于果肉中,GA显著提高果实膨大中后期SPS的表达水平。蔗糖合成酶基因(SS)在果实膨大前期和中期表达水平较高,GA处理抑制SS表达。GA处理显著提高梨果肉和果芯组织中的可溶性糖含量,GA诱导糖代谢相关酶的基因的表达,并在果芯和果肉中存在组织特异性表达。